李一平，沈汉国，喻国辉，王　燕，李　驰，叶志文，周东辉，吴绪波

（珠海市现代农业发展中心，广东 珠海　519070）

一种芽胞杆菌生物被膜形成缺陷培养基的研究

李一平，沈汉国，喻国辉，王燕，李驰，叶志文，周东辉，吴绪波

（珠海市现代农业发展中心，广东 珠海519070）

为寻找一种不支持芽胞杆菌正常形成生物被膜的培养基，比较枯草芽胞杆菌R31和168菌株在MSgg、NB、LB、BGM固体和液体培养基中形成的生物被膜形态差异，确定R31和168菌株生物被膜形成能力差异；根据R31在MSgg、NB、BGM培养基中振荡培养的生长方式设计出BGM1和BGDM培养基，测定R31在BGM1和BGDM培养基上的生长曲线并比较R31菌株和168菌株在BGM1和BGDM上生物被膜形成的差异，然后测定枯草芽胞杆菌TR21菌株、解淀粉芽胞杆菌R21g9菌株、短芽胞杆菌L1菌株、胶质芽胞杆菌L2菌株在BGM1和BGDM培养基上生物被膜形成情况。结果显示，R31在MSgg、NB、LB、BGM液体培养基表面形成薄皮，在MSgg、LB固体培养基和NA上形成具有褶皱的菌落，在BGM上形成光滑的菌落，R31在这些培养基中形成的生物被膜比168菌株厚实。R31在MSgg和BGM中早期（2 h）以游离状态生长，对数生长期（4 h）菌体黏连出现链状，对数生长中后期（8 h）菌体呈现网状结构，但在NB培养基中主要以游离状态生长，显示营养而非培养条件影响R31的生长方式。于是将BGM培养基中的酵母提取物换为牛肉膏获得BGM1培养基，将BGM1培养基的胰蛋白胨改为细菌学蛋白胨得到BGDM培养基，并发现R31和168菌株可以在BGM1上形成薄皮和菌落，不能在BGDM培养基上形成完整的薄皮和具有褶皱的菌落。待测菌株均能够在BGM1培养基上形成厚薄程度有差异的薄皮和有褶皱的菌落，均不能在BGDM培养基上形成薄皮和具有褶皱的菌落。在BGDM中添加甘油或Mn可以恢复R31形成薄皮和扩散的褶皱菌落。芽胞杆菌在BGDM培养基上不能正常形成薄皮和具有褶皱的菌落，BGDM可以用于筛选促进生物被膜形成的物质。

枯草芽胞杆菌；生物被膜；培养基；菌落；薄皮

李一平，沈汉国，喻国辉，等. 一种芽胞杆菌生物被膜形成缺陷培养基的研究［J］.广东农业科学，2016，43（9）：98-104.

生物被膜（bioflim）是指微生物为了适应环境，粘附于非生物或活性组织表面，分泌大量的多糖、蛋白质和核酸等不均一的胞外基质，将菌体自身包裹在其中而形成的大量菌体聚集膜样物［1］。近年来针对枯草芽胞杆菌的生物被膜形成及其机理开展了大量的研究［1-3］。组成枯草芽胞杆菌生物被膜的胞外基质包括多糖［4］和蛋白质［5］，生物被膜形成后可赋予枯草芽胞杆菌适应干燥或其他虽然存在胁迫因子但营养充足的环境［3，6-7］。

枯草芽胞杆菌生物被膜形成能力与其防治病害的能力相关。枯草芽胞杆菌6051菌株的突变体失去生物被膜形成能力后不能在拟南芥根系定殖，失去了防治丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv tomato）DC3000菌株引起病害的能力［8］。枯草芽胞杆菌NCD-2能够防治棉花立枯病，敲除与生物被膜形成相关的基因ywbB后，菌株生物被膜形成能力下降，并降低了对棉花立枯病的防治效果［9］。枯草芽胞杆菌UMAF6614失去产生表面活性素的能力后引起生物被膜形成能力和在甜瓜叶片表面定殖能力受损，相应的防病能力也显著降低［10］。

枯草芽胞杆菌R31是一种具备香蕉枯萎病生物防治能力的植物内生菌［11］，要筛选一些能够促进R31生物被膜形成的物质作为增效因子来提高R31在香蕉根际定殖，需要寻找一种合适的培养基来开展相关的研究。实验室内主要采用观察芽胞杆菌菌株在固体表面形成菌落（colony）和液体表面形成薄皮（pecille）［2］的形态差异来判断生物被膜形成能力的变化，使用最多的是MSgg培养基［12］，大部分野生型芽胞杆菌能够在MSgg培养基上形成具有褶皱的菌落和薄皮。除了MSgg培养基外，用于评估枯草芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基还有BGM（biofilm growth medium）培养基［6］。MSgg培养基能够促进大多数芽胞杆菌形成生物被膜，不适合筛选对生物被膜具有促进效果物质及其浓度的研究。Shemesh等［13］发现在LB培养基中加入甘油和Mn后可以促进枯草芽胞杆菌3610菌株在LB培养基上形成薄皮和褶皱的菌落。枯草芽胞杆菌R31可以在LB培养基上形成生物被膜，为了获得一种生物被膜形成缺陷培养基用于评估和筛选影响枯草芽胞杆菌R31生物被膜形成的物质，本研究通过比较生防枯草芽胞杆菌R31菌株和168菌株在不同培养基上的生物被膜形成差异，获得R31和168生物被膜形成能力数据，然后根据R31在不同培养基中的生长差异在BGM的基础上设计出BGM1和BGDM（biofilm growth defective medium），并根据R31和168菌株在BGM1和BGDM培养基上的生物被膜形成情况，确定该培养基的确不支持枯草芽胞杆菌形成薄皮和具有褶皱的菌落，最后选择了几种具有生防能力的芽胞杆菌开展生物被膜形成验证，确定设计出的培养基的确不支持芽胞杆菌的生物被膜形成，然后在BGDM中添加甘油或Mn离子验证了两种物质对R31被膜形成的促进作用。研究获得的培养基可以用于筛选促进生物被膜形成的物质。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试菌株：枯草芽胞杆菌（Bacillus subtlis）R31［11］、TR21［14］、168，解淀粉芽胞杆菌（B. amyloliquefaciens）R21g9［15］、短芽胞杆菌L1（Brevibacillus sp.）、胶质芽胞杆菌（B. mucilaginosus）L2［16］等菌株均由珠海市现代农业发展中心植物保护研究室保存。

供试培养基：MSgg培养基［12］，BGM培养基［6］，LB培养基，NB培养基。BGM1培养基：将BGM培养基中的酵母提取物换为牛肉膏3 g。BGDM培养基：将BGM1培养基中的胰蛋白胨换成同样浓度的细菌学蛋白胨。在以上液体培养基中加入1.5%的琼脂粉制备固体培养基。

1.2试验方法

1.2.1R31和168 菌株在不同培养基上生物被膜形成观察 将R31或168保藏液在LB固体平板上划线活化后，挑单菌落接种于5 mL LB液体培养基中于37℃，200 r/min振荡培养过夜，使OD600值达到0.8以上，然后用新鲜的LB培养基稀释菌液，使菌液的OD600达到0.02，用作菌种液。灭菌后的待测液体培养基（MSgg、BGM、NB、LB、BGM1和BGDM）按照15 mL左右每支平板的量加入无菌平板或2 mL的量加入24孔细胞培养板中，将菌种液9 μL或2 μL滴加在培养液的表面，盖上皿盖后30℃静置培养72 h，对形成的薄皮拍照。

在待测培养基中加入1.5%琼脂制成固体培养基（MSgg、BGM、NA、LB、BGM1和BGDM），倒平板后吹干，将菌种液5 μL滴加在平板中央，30℃静置培养72 h，对形成的菌落拍照。

1.2.2R31菌株在不同培养基中的生长曲线和生长方式观察 将R31保藏液在LB固体平板上划线活化后，挑单菌落接种于5 mL LB液体培养基中于37℃、200 r/min振荡培养过夜，按1%的接种量转接到100 mL 待测培养基（MSgg、BGM、NB、BGM1和BGDM）中，37℃、200 r/ min振荡培养，以未接种的待测液体培养基作空白对照，取不同培养时间的菌液在600 nm波长下进行光电比浊测定，以不同培养时间细菌悬浮液的OD值为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制生长曲线。同时取不同时间的菌液制片，结晶紫染色，在油镜下观察菌体生长方式。NB和BGDM培养基中菌体较少或以游离形式存在，用结晶紫染色观察效果不明显，因此制片后未染色。

1.2.3待测菌株在BGM1和BGDM培养基上生物被膜形成测定 测定方法同1.2.1。

1.2.4甘油和Mn离子对R31在BGDM培养基上生物被膜形成的影响 测定方法同1.2.1。在BGDM培养基中分别加入1%甘油、80 μg/mL MnSO4、1%甘油+80 μg/mL MnSO4以测定甘油和Mn离子单独或组合对R31生物被膜形成的影响。

试验数据采用Excel 2003软件进行处理，并绘制生长曲线。

2　结果与分析

2.1R31和168菌株在不同培养基上的生物被膜形成观察

枯草芽胞杆菌R31菌株可以在LB、NA和MSgg固体培养基上形成具有褶皱和突起的菌落，但在固体BGM培养基上形成的褶皱不明显；168菌株不能在LB、NA、MSgg和BGM上形成具有褶皱的菌落（图1A，彩插一）。R31可以在LB、NA、MSgg和BGM上形成完整的薄皮（图1B彩插一），其中在MSgg上形成的薄皮具有皱褶；168菌株也可以在LB和MSgg上形成无褶皱的薄皮，在NB和BGM上形成的薄皮存在一定缺陷。由图1可知，基于枯草芽胞杆菌R31和168菌株在4种培养基上的生物被膜形成状况可知枯草芽胞杆菌R31菌株的生物被膜形成能力比168菌株强。

2.2R31菌株在不同培养基中的生长曲线和生长方式观察

由图2可知，R31菌株在BGM培养基中没有明显的迟滞期（图2A），对数生长期从0 h到18 h；R31在MSgg和NB均有明显的迟滞期（图2B），其中在MSgg培养基中的迟滞期约2.5 h，在NB中则达到了3.5 h。R31菌株在MSgg培养基中生长迅速，在6.5 h结束对数生长，但在NB培养基中对数生长期到10 h结束，说明R31菌株在MSgg培养基中的菌体浓度比在NB中高。

图2　R31菌株在不同培养基中的生长曲线

R31菌株在DSM培养基中的生长方式见图3（彩插一）。在显微镜下观察，发现R31菌株在该培养基中培养1.5 h，菌体形成长杆状结构；培养2.5 h菌体同时出现长杆状和短杆状，并且出现黏连；培养3 h菌体的杆状长度开始变短，菌体聚合度进一步增加；培养3.5 h菌体全部呈现短杆状，并聚集形成网状雏形；培养4 h菌体大量聚集，形成有空洞的网格结构；培养4.5 h菌体形成致密的、规则的中空网状结构。

R31菌株在MSgg培养基中的生长方式见图4（彩插一）。培养2.5～4.5 h菌体均以短杆状方式生长，培养5.5 h可观察到短杆状的菌体开始聚集，随着时间的延长，聚集越来越明显，并最终形成具有中空的网状结构，培养10 h菌体在显微镜下显示出网络状结构。

R31菌株在NB培养基中完全以游离状态生长，其生长过程见图5（彩插一）。培养1.5 h，仅观察到有少量长杆状游离菌体；培养2.5 h，菌体密度有所增加，大部分菌体以短杆状出现，偶然见到长杆状游离菌体；此后所有时间点的观察结果都显示，R31菌株在NB培养基中以游离的状态生长，不出现聚集和链状结构。

此外，王燕等［17］的研究显示，R31在LB中能够快速生长，生长速度与在MSgg中的相当，并且生长方式也与MSgg类似，菌体培养8 h形成三维网状结构。基于R31在BGM、LB和NB培养基中的生长差异，说明不同培养基中的营养差异可能是引起菌体生长差异的原因。因此以BGM培养基为基础，将其中的酵母提取物换成牛肉膏得到BGM1培养基，将BGM1中的胰蛋白胨换成细菌性蛋白胨，形成BGDM培养基。

图6　R31菌株在BGM1和BGDM培养基中的生长曲线

2.3R31菌株 在BGM1和BGDM中的生长曲线

测定R31菌株在BGM1和BGDM培养基中的生长曲线（图6），发现R31在BGM1培养基上可以正常生长，延缓期约2 h，此后迅速生长，但在BGDM培养基中不能正常生长，迟滞期长达15 h。说明两种不同的蛋白胨影响了R31的生长。在显微镜下观察，R31在BGM1和BGDM培养基中的生长方式见图7（彩插二）。在显微镜下观察，发现R31在该培养基中培养2.5 h，菌体相互黏连；培养3.5 h，菌体出现长杆状和网状结构；培养4.5 h，菌体的聚合度进一步增加；培养5.5 h，菌体大量聚集；培养7.5 h，菌体形成有空洞的网格结构；培养8.5 h，菌体形成致密的、规则的中空网状结构。R31菌株在BGDM培养基中以游离方式生长（图8，彩插二），与R31在NB培养基中的生长方式类似。

2.4R31和168菌株在BGM1和BGDM中生物被膜形成差异

R31和168菌株在BGM1和BGDM培养基中形成的生物被膜存在明显差异（图9，彩插二）。生物被膜形成能力弱的168菌株不能在BGM1中形成明显的菌落，在BGM1液体培养基上形成的薄皮不能覆盖整个平板，不能在BGDM培养基中形成明显的菌落和薄皮。R31的生物被膜形成能力比168强，能够在BGM1培养基中形成稳定的薄皮和表面具有突起的菌落，但不能在BGDM培养基中形成薄皮，在BGDM培养基上形成的菌落光滑无突起。从168和R31菌株在BGM1和BGDM培养基上形成生物被膜的能力和形成薄皮的结构差异来看，BGDM培养基不支持枯草芽胞杆菌生物被膜的形成。

2.5几种待测芽胞杆菌菌株在BGM1和BGDM中生物被膜形成差异

待测菌株在BGM1和BGDM上形成的薄皮和菌落形态存在明显差异。由图10（彩插二）可知，待测菌株可以在BGM1固体培养基上形成具有不同程度突起的菌落（图10A，彩插二），在BGDM培养基上仅能形成光滑的菌落；所有待测菌株均能在BGM1上形成薄皮（图10B，彩插二），不同菌株长出的薄皮厚度存在差异，R21g9和L1形成的薄皮最厚，其次为L2，枯草芽胞杆菌TR21菌株在BGM1上形成的薄皮最薄；所有菌株在BGDM上均不能形成完整的薄皮，R21g9的形成较厚的漂浮物但不能铺满整个平板，TR21能形成薄的漂浮物，也不能铺满整个平板，另外2株芽胞杆菌则完全不能形成薄皮。

待测菌株分别属于枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、胶质芽胞杆菌和短芽胞杆菌，不同类型的芽胞杆菌均不能在BGDM上形成薄皮，显示BGDM培养基抑制芽胞杆菌薄皮形成可能在产芽胞细菌中是保守的。

2.6甘油和Mn对R31在BGDM上生物被膜形成的影响

为了进一步验证筛选获得的BGDM是否适合用于生物被膜形成促进物质筛选，选择2种已经证明可以促进芽胞杆菌生物被膜形成的物质甘油和Mn，在BGDM中添加甘油和Mn可以恢复R31薄皮的形成（图11，彩插二），R31在BGDM中不能形成薄皮，但在BGDM中加入1%的甘油可以形成褶皱十分明显的薄皮。R31在BGDM中形成光滑的菌落，加入1%的甘油后，菌落表面出现突起。Mn离子单独添加能够恢复R31在BGDM中薄皮的形成，但形成的薄皮不具备皱褶，形成的菌落也不具备皱褶但具备扩散性状。在BGDM培养基中同时加入甘油和Mn后，可以观察到R31的菌落和薄皮的形态发生变化，薄皮的皱褶更加明显，菌落除了具备扩散特性外，还长出微弱突起。

3　结论与讨论

用于土传病害生物防治的芽胞杆菌如果能够在作物根际快速形成生物被膜并长期定殖，有利于病害的防治。本试验通过比较广谱抗真菌枯草芽胞杆菌R31在不同培养基中生长和生物被膜形成的差异，发现培养基类型影响其生长和生物被膜的形成，并在此基础上设计出BGM1和BGDM培养基，通过比较R31和168菌株在BGM1和BGDM上生物被膜形成能力变化，发现BGDM培养基不支持枯草芽胞杆菌形成薄皮和具有褶皱的菌落。为了进一步验证这一现象是否为产芽胞细菌中的保守现象，还测试了其他几株广谱抗真菌芽胞杆菌在BGM1和BGDM上形成生物被膜的差异，发现被测定的芽胞杆菌菌株可以在BGM1上形成薄皮和表面有突起的菌落，但不能在BGDM培养基上形成稳定的薄皮和具有突起的菌落。在BGDM培养基中加入甘油或/和Mn后能够恢复R31生物被膜的形成。本试验结果表明，不同菌株在BGM1和BGDM培养基上生物被膜形成能力的差异显示这种对蛋白胨利用的差异可能是产芽胞细菌中的保守功能，可以利用BGDM培养基来开展促进生物被膜形成物质的筛选和评估。

枯草芽胞杆菌168菌株是一种实验室驯化的芽胞杆菌，其生物被膜形成能力退化，而枯草芽胞杆菌R31是一种野生型枯草芽胞杆菌，具有较强的生物被膜形成能力，这两株芽胞杆菌在不同培养基中的生物被膜形态存在较大差异，主要表现为薄皮的厚度以及菌落的褶皱情况。LB、NB、BGM、MSgg培养基都支持R31菌株形成薄皮和具褶皱的菌落，支持168形成薄皮，但不支持168形成具有褶皱的菌落，尤其是MSgg培养基，R31和168菌株形成的菌落存在显著差异，R31在MSgg上形成与NCBI3610类似的菌落，但形成的薄皮不如3610的褶皱明显［12］。

对枯草芽胞杆菌摇瓶生长方式的观察发现R31菌株在不同培养基中的生长方式存在差异，R31仅在NB培养基中以游离的状态生长，在LB［17］、MSgg和BGM中均显现出生物被膜形成时的生长特性，如生长早期菌体之间连接形成长杆状，生长中后期菌体之间大量聚集并形成网状结构，这些观察结果与NCBI3610在静置培养形成生物被膜时的生长方式一致［12］，说明影响枯草芽胞杆菌生长方式的不是培养方式而是营养类型，尤其是蛋白质的类型。

枯草芽胞杆菌可以通过KinD蛋白激酶的胞外结构域识别甘油［13］，并激发Spo0A磷酸化，最终激发epsA-O操纵子和tapA操纵子表达，其中epsA-O操纵子编码胞外多糖EPS生物合成所需的酶［4］，而tapA操纵子则合成组成胞外基质的淀粉样蛋白TasA［5］。Shemesh和 Chai［13］发现KinD的胞外结构域并不能识别Mn，但是单独添加甘油却无法刺激3610在LB中形成具有褶皱的薄皮和菌落，单独添加Mn也无法刺激3610在LB中形成具有褶皱的菌落和薄皮，显然Mn离子通过一种未知的途径激发了3610在LB中的生物被膜形成。BGM培养基以LB为基础，R31在这个培养基中可以形成薄皮和表面具有微弱褶皱的菌落，当BGM中的LB换成NB后，R31不仅不能正常的形成薄皮和具有褶皱的菌落，生长也受到了抑制，迟滞期长达12 h以上。在BGDM中添加Mn离子或甘油或同时添加2种物质，可以显著促进R31的薄皮形成，但不同物质在对菌落形态方面的影响存在差异，单独添加甘油增加了BGDM培养基上菌落的突起，而单独添加Mn则使菌落具备扩散形态。同时增加甘油和Mn时，菌落增加了褶皱和扩散。显然甘油和Mn离子通过不同的途径在影响BGDM中R31的生长。BGM1和BGDM培养基唯一的差异为蛋白胨的类型，结合R31在两者中的生长方式差异，可能Mn离子添加促进了R31对胞外蛋白的利用，这需要进一步验证。

生物被膜形成能力的强弱能够影响菌株在植物根际的定殖并对防效产生影响，在筛选生防微生物时，除了采用传统的方法评价菌株对病原菌的广谱拮抗活性外，可以考虑增加生物被膜形成能力评估，可能有利于提高生防菌筛选效率和田间防治效果。如枯草芽胞杆菌R31菌株是一株广谱抗菌植物内菌［17］，能够形成生物被膜［18］，能够在香蕉和粉蕉的根表、根际土、根和球茎中长期定殖［19］，在巴西蕉中的研究发现，R31接种后60 d在根表的定殖量是接种后1 d的2.8倍［19］，而TR21在巴西蕉根际接种后15 d，根表定殖的菌量为接种后1 d 的2.07 ×10-4倍［20］。R31在大田与香蕉抗病品种结合的防效达到81.86%［21］，与TR21在同一块地同一种浓度开展防效验证时对巴西蕉枯萎病的防治效果［22］显著高于TR21菌株［23］，第一年度R31和TR21对巴西蕉枯萎病的防治效果分别为82.40%和63.23%，第二年度R31和TR21对巴西蕉枯萎病的防治效果分别为94.35%和73.90%。本研究发现两者的生物被膜形成能力也存在明显的差异，R31在BGM中能够形成厚的薄皮和具有褶皱的菌落，而TR21仅能够形成薄的薄皮，形成的菌落也不具备褶皱。

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（责任编辑 邹移光）

Study on a bacillus biofilm growth defective culture medium

LI Yi-ping，SHEN Han-guo，YU Guo-hui，WANG Yan，LI Chi，YE Zhi-wen，ZHOU Dong-hui，WU Xu-bo
（Zhuhai Modern Agriculture Development Center，Zhuhai 519070，China）

To find a culture medium could not support bacillus biofilm formation，the colony and pellicle morphological differences of Bacillus subtilis stain R31 and 168 in solid and liquid MSgg，NB，LB and BGM medium were compared to make sure the biofilm formation difference of the two strains. Based on the different growth process of R31 in liquid MSgg，NB and BGM on shaking cultivation，two culture mediums were designed and named BGM1 and BGDM. The growth curve and process of R31 in BGM1 and BGDM were checked and the colony and pellicle morphological differences of R31 and 168 developed in BGM1 and BGDM were compared. Finally，the biofilm morphological differences of B. subtilis strain TR21，B. amyloliquefaciens strain R21g9，Brevibacillus sp. strain L1 and B. mucilaginosus strain L2 in BGM1 and BGDM were studied. Results showed that R31 could develop integrated pellicle in liquid MSgg，NB，LB and BGM medium，and develop wrinkle colony in solid MSgg，LB and NAmedium，but develop smooth colony in solid BGM medium. The biofilm of R31 in these mediums were more robust than that of 168. The cells of R31 grew freely in MSgg and BGM medium in the early stage （2 h） of cultivation，the cells attached to each other and linked like a chain in logarithmic phase （4 h），and the cell morphology looked like a net in the end of logarithmic phase （8 h），but R31 cells grew freely in NB culture medium at the whole growth process. These results showed that nutrition but not cultural condition affected the growth process of R31. So the yeast extract in BGM was changed as beef extract and the medium named BGM1，and tryptone of BGM1 was changed as peptone and the medium was named BGDM. R31 and 168 could develop pellicle and colony in BGM，but all couldn’t develop pellicle and winkle colony in BGDM medium. All the tested bacillus strains could develop integrated pellicle with different thickness and wrinkle colony in BGM1，but they all could not develop integrated pellicle and wrinkle colony in BGDM medium. Glycerol or Manganese were added in BGDM could recover the integrated pellicle and wrinkle spread colony formation of R31. Bacillus strains could not develop normal pellicle and winkle colony in BGDM medium，and this medium could be used to select the materials.

Bacillus subtilis；biofilm；culture medium；colony；pecille

S482.2+92

A

1004-874X（2016）09-0098-07

2016-06-07

广东省科技计划项目（2014A020208015）

李一平（1974-），男，高级农艺师，E-mail：425024563@qq.com

喻国辉（1976-），男，博士，研究员，E-mail：ygh76411@163.com