韩滨，马晓峰，张超

急性脑卒中患者外周血单个核细胞来源的AChE相关的microRNAs的表达变化

韩滨，马晓峰，张超△

目的探讨急性脑卒中患者外周血单个核细胞内乙酰胆碱酯酶（AChE）相关的microRNAs的表达变化。方法利用microRNAs的预测软件并结合文献，筛选靶向AChE的microRNAs。收集发病24 h以内的急性脑卒中患者和与之相匹配的对照组人群，留取静脉血提取单个核细胞。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测microRNAs和AChE mRNA的表达，利用Western blot技术检测AChE蛋白的表达。结果预测的靶向AChE的microRNAs包括microRNA（miR）-24、-28、-124、-132、-182*、-194、-484。与对照组相比，脑卒中患者外周血单个核细胞内miR-24、-124、-132和-194表达升高（P＜0.05），miR-28、-182*及-484无明显变化，AChE mRNA和蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论脑卒中时miRNAs可能通过靶向AChE增强胆碱能抗炎通路。

卒中；乙酰胆碱酯酶；微RNAs；外周血单个核细胞；胆碱能抗炎通路

脑卒中是引起人类死亡的第二大原因和致残的主要原因［1］。研究表明microRNAs（miRNAs）参与了缺血性血管事件后续的病情发展［2-4］。miRNAs是一类高度保守的短链非编码RNAs，通过转录后调控发挥作用，其在免疫炎症性疾病的发展中发挥着非常重要的作用［5］。在脂多糖诱导的小鼠体内炎症中，miR-132可通过靶向乙酰胆碱酯酶（AChE）加强胆碱能抗炎信号，减轻炎症水平［6］。在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中，升高miR-132的水平可以减轻小鼠的发病症状［7］。这种作用被用来治疗应激诱发的认知缺陷［8］。胆碱能抗炎通路由迷走神经传入纤维、中枢及迷走神经传出纤维组成，在神经系统与免疫系统的交流中发挥着重要的桥梁作用［9］。AChE可以调节胆碱能状态，其活性可以作为反映炎症状态的指标［10］。本研究旨在探讨AChE相关的miRNAs对于脑卒中后炎症的调节作用，为治疗脑卒中提供新的治疗策略。

Tab.1The stem-loop primers of different genes表1 各基因茎-环引物序列

1 对象与方法

1.1 研究对象于2015年10月—2016年4月在天津医科大学总医院住院的102例急性缺血性脑卒中患者中筛选出30例患者作为脑卒中组。入组标准:（1）发病时间＜24 h。（2）年龄＞18岁。（3）经头颅CT或MRI诊断为前循环的脑梗死。排除标准:（1）合并感染。（2）合并肿瘤。（3）孕妇。（4）出血性脑卒中。（5）合并慢性炎症或自身免疫性疾病。（6）合并认知障碍。收集于我院进行体检的健康成人30例作为对照组。脑卒中组平均年龄（62.62±10.97）岁，男17例，女13例；对照组平均年龄（61.79±10.89）岁，男15例，女15例。2组之间年龄（t=0.294）、性别（χ2=0.268）差异无统计学意义。本研究经天津医科大学伦理委员会批准。

1.2 试剂和仪器Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；RNA反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；SYBR试剂（德国Roche公司）；AChE抗体（美国Santa Cruz公司）；实时荧光定量PCR仪CFX ConnectTM、Bio-Rad ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析系统、Bio-Rad MyCycler普通PCR仪（美国Bio-Rad公司）；NanoDrop 2000C超微量分光光度计、BiofugeStratos高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；Sartorius analytic A 1205万分之一分析天平（美国Sartorius公司）；QL-866-旋涡混合器（中国其林贝尔公司）。

1.3 方法

1.3.1 外周血单个核细胞（PBMCs）分离用含EDTA的抗凝管抽取患者静脉血后立即置于冰上，以3 000 r/min的速度离心10 min，吸取上层血浆冻存于-80℃冰箱；下层的血沉淀加入等体积的PBS稀释，随后将稀释后的血沉淀缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液中，2 000 r/min，慢升、慢降，离心20 min。离心结束后，管底为红细胞，中间层为分离液，上层为血浆层，血浆层与分离液层之间有一层较致密的白膜，小心吸取白膜即得到PBMCs。

1.3.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测miRNAs及AChE的表达利用Trizol试剂从新鲜的PBMCs中提取出总RNA，并利用超微量分光光度计测定浓度。取1 μg总RNA作为模板，miRNAs采用茎-环引物进行反转录，AChE采用Oligo（dT）引物进行反转录，根据RNA反转录试剂盒建立20 μL的反转录体系，进行逆转录得到cDNA，茎-环引物序列见表1。然后根据SYBR的说明书，取2 μL cDNA进行实时定量检测，每个样本基因重复3次，反应条件为:预变性95℃10 min，随后变性95℃15 s，退火58～61℃30 s，延伸72℃20 s，39个循环。利用2-ΔΔCt法计算每个基因的相对表达量。U6作为miRNAs的内参，β-actin作为AChE的内参。引物序列见表2。

Tab.2The PCR primers of different genes表2 各基因实时定量引物序列

1.3.3 Western blot检测AChE蛋白新鲜提取的PBMCs经裂解液裂解后，通过CBA试剂盒检测蛋白的浓度，随后加入上样缓冲液煮沸10 min，使蛋白变性。然后用10%的SDSPAGE胶进行电泳分离，之后将蛋白转膜至PVDF膜上。经5%的脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入TBST稀释的一抗，摇床置于4℃冰箱中，慢摇、孵育过夜。第2天用TBST洗涤一抗，随后加入相应二抗室温孵育1 h后，进行曝光，通过Image J软件检测灰度值。一抗的浓度为鼠抗-AChE（1∶100），内参蛋白为鼠抗-GAPDH（1∶1 000）。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x¯±s）表示，2组间比较用独立样本t检验，计数资料2组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 预测靶向AChE的miRNAs利用Targetscan、Pictar、miRanda［11］并结合文献，选取了高度保守的miRNAs，然后选取预测软件及文献的重叠部分，最终确定了7种miRNAs，包括:miR-24、-28、-124、-132、-182*、-194及-484。

2.2 PBMCs内相关miRNAs的变化与对照组相比，脑卒中组PBMCs内miR-24、-124、-132和-194的表达均升高（P＜0.05），miR-28、-182*和-484无明显变化，见表3。

Tab.3The expression levels of 7 kinds of miRNAs in PBMCs detected by qRT-PCR表3 qRT-PCR检测PBMCs内7种miRNAs的表达变化（n=30，）

Tab.3The expression levels of 7 kinds of miRNAs in PBMCs detected by qRT-PCR表3 qRT-PCR检测PBMCs内7种miRNAs的表达变化（n=30，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别对照组脑卒中组t miR-24 1.09±0.48 1.79±0.76 4.209＊＊miR-28 1.10±0.10 1.06±0.27 1.125 miR-124 1.07±0.43 1.87±1.30 3.214＊miR-132 1.02±0.19 1.49±0.43 5.480＊＊组别对照组脑卒中组t miR-182* 1.20±0.82 1.24±1.01 0.185 miR-194 1.03±0.26 1.38±0.83 2.304＊miR-484 1.14±0.54 1.17±0.59 0.170

2.3 PBMCs内AChE的变化与对照组相比，脑卒中组AChE mRNA表达降低，Western blot定量结果表明AChE蛋白表达水平亦降低（均P＜0.05），见表4、图1。

Tab.4The changes of AChE mRNA and proteins表4 AChE mRNA及蛋白水平的变化（n=15，）

Tab.4The changes of AChE mRNA and proteins表4 AChE mRNA及蛋白水平的变化（n=15，）

＊＊P＜0.01

组别对照组脑卒中组t AChE mRNA 1.00±0.32 0.41±0.29 5.224＊＊AChE蛋白灰度比值1.00±0.12 0.53±0.14 9.880＊＊

Fig.1The expression levels of AChE proteins图1 AChE蛋白水平的变化

3 讨论

研究表明人体内AChE直接或间接地参与调节炎症反应，已经证实其在多种疾病中可作为体内炎症的一个指标，如脑卒中［10］和炎症性肠病［11］。AChE通过调节ACh水平参与调节炎症反应。本研究预测了靶向AChE的miRNAs，包括miR-24、-28、-124、-132、-182*、-194和-484。一种miRNA可以靶向多种mRNA，并且一种mRNA也可有多种miRNAs靶向相应的3′端非编码区（3′-UTR）［12］，为预测靶向AChE的多种miRNAs提供了理论基础，本研究预测结果符合这一基本原则。研究进一步探讨了上述miRNAs在急性脑卒中患者和健康人群中的变化，结果显示，与对照组相比，脑卒中组miR-24、-124、-132和-194的表达出现了升高，而miR-28、-182*和-484没有明显变化。有研究显示，青年卒中患者外周血miR-24和-194水平升高，而miR-28、-182*和-484也没有明显变化［3］，与本研究不同的是，没有检测到miR-124和-132水平的变化，考虑原因可能为研究对象之间年龄存在较大差异。miR-132可通过靶向AChE加强胆碱能抗炎通路的强度［6］，在炎症状态下，miR-132表达升高，本研究与之相符。同时，胆碱能系统参与调节miR-124的表达，减少了白细胞介素（IL）-6及肿瘤坏死因子（TNF）-α的产生，减轻了炎症反应［13］，提示miR-124在炎症调节中发挥着一定的作用。本研究证实miR-124发生了明显的变化，提示miR-124参与了脑卒中炎症的调节。

与对照组相比，脑卒中患者PBMCs内AChE mRNA及蛋白表达出现下降，提示这些miRNAs可能参与了AChE的转录后调控，加强了胆碱能抗炎信号，从而参与了卒中后炎症的调节。有研究显示，脑卒中患者AChE的活性下降［10］，与本研究结果一致。卒中患者PBMCs内乙酰胆碱的分解酶AChE发生了剧烈的变化，提示在脑卒中患者体内AChE扮演着非常重要的角色。本研究有一些局限性:（1）未证实异常变化的miRNAs直接靶向AChE，从而发挥转录后调控的作用。（2）影响胆碱能系统的因素较多，如年龄、情绪等，需更好地控制混杂因素的影响。

综上所述，靶向AChE的miR-24、-124、-132和-194在脑卒中组的表达水平高于健康对照组，且AChE的水平与炎症有关，这些miRNAs可能具有调节脑卒中患者体内炎症的功能。因此对这些miRNAs的研究可能为以后脑卒中的诊断、治疗及研究提供一种新的方向和策略。

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（2016-06-06收稿2016-07-07修回）

（本文编辑李国琪）

The change of AChE related microRNAs derived from peripheral blood mononuclear cells in acute ischemic stroke

HAN Bin，MA Xiaofeng，ZHANG Chao△
Department of Neurology，Tianjin Neurological Institute，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China△

ObjectiveTo investigate the expression changes of acetylcholinesterase（AChE）related microRNAs derived from peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in patients with stroke.MethodsThe microRNAs for targeting AChE mRNA were selected via prediction software and previous studies.PBMCs were extracted from venous blood samples of acute ischemic stroke patients（onset＜24 h）and healthy controls.The expressions of microRNAs and AChE mRNA were quantified using real-time PCR（RT-PCR）.The protein level of AChE was detected by Western blot assay.ResultsThepredicted microRNAs included microRNA（miR）-24，-28，-124，-132，-182*，-194 and-484.The expression levels of miR-24，-124，-132 and-194 were significantly elevated in stroke patients compared with those of controls（P＜0.05）.There were no significant changes in expression levels of miR-28，-182*and-484.Additionally，the relative expression levels of intracellular AChE mRNA and protein decreased significantly in stroke patients（P＜0.05）.ConclusionMiRNAs can enhance cholinergic anti-inflammatory pathway by targeting AChE in patients with acute ischemic stroke.

stroke；acetylcholinesterase；microRNAs；peripheral blood mononuclear cells；cholinergic antiinflammatory pathway

R741

A

10.11958/20160518

国家自然科学基金资助项目（81401361）

天津医科大学总医院神经内科（邮编300052）

韩滨（1988），男，硕士，主要从事神经免疫性疾病的基础与临床研究

△通讯作者E-mail:bjyb254@163.com