杨帅，陈娟，佘佐亚，陈相宜，蔡捷，邝晓聪

(1广西医科大学病理生理教研室，南宁530021；2广西医科大学护理学院；3广西医科大学实验中心)



·论著·

肝癌干细胞体外富集模式的构建

杨帅1，陈娟1，佘佐亚2，陈相宜1，蔡捷3，邝晓聪1

(1广西医科大学病理生理教研室，南宁530021；2广西医科大学护理学院；3广西医科大学实验中心)

目的构建肝癌干细胞体外富集模式。方法选择肝母细胞瘤HepG2细胞系，以有限稀释法培养体外单细胞，观察体外单细胞克隆培养的克隆细胞生长曲线和形成全克隆、部分克隆以及旁克隆的比例，选取全克隆逐级扩增，取1×104和1×106的HepG2细胞进行裸鼠皮下成瘤实验，qRT-PCR检测全克隆癌干细胞表面标志物ABCG2、ALDH1A3、CD44、CXCR4、OCT4 mRNA，悬浮球形成实验计算全克隆悬浮球形成率。对全克隆细胞加0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01 μg/mL浓度的阿霉素干预48 h，观察全克隆生长情况；对于干预后存活的全克隆全部进行逐级扩增和裸鼠荷瘤实验。结果HepG2细胞克隆形成率为32.78%±9.03%，其中全克隆、部分克隆、旁克隆百分比分别为7.12%±2.96%、62.67%±13.39%、30.21%±14.87%；所有全克隆均可逐级扩增；1×104、1×106个HepG2细胞全克隆接种裸鼠成瘤率分别为12.5%、100%；与HepG2细胞相比，单细胞全克隆ABCG2、CD44、ALDH1A3、CXCR4和OCT4表达倍数分别为2.26±0.33、2.67±0.55、3.96±1.56、2.56±0.55、1.05±0.40，两者ABCG2、ALDH1A3、CD44、CXCR4相比,P均<0.05；只有HepG2全克隆细胞可形成悬浮球。单细胞克隆培养后的全克隆进行阿霉素干预，发现仅加入0.1、0.05、0.01 μg/mL阿霉素的HepG2细胞全克隆存活，接种裸鼠成瘤率均为100%。结论成功构建了肝癌干细胞体外富集模式。

肿瘤干细胞；肝癌干细胞；细胞全克隆；细胞培养

目前，肿瘤干细胞的分离和富集方法主要有流式分选、磁式分选以及“悬浮球”培养等方法[1,2]，其主要是依据肿瘤干细胞“干性”、耐药性、特殊功能细胞标志以及干细胞特性进行实施的，并多认为是得到了富含肿瘤干细胞的细胞群体，未获取到高纯度甚至单纯的肿瘤干细胞。其中，流式分选对癌细胞活性有一定影响，磁式分选获得细胞量较少，“悬浮球”培养需要特殊的条件培养基。因此，有研究者把干细胞和白血病干细胞在体外单细胞培养会形成全克隆类型的细胞集落实验结论加以扩展，认为单个癌细胞形成的全克隆富含肿瘤干细胞，其细胞群体也表现出肿瘤干细胞的恶性特征[3]，该方法简单易行且可保持细胞活性，但不足之处是全克隆的判定依据是形态学标准(如细胞克隆的形状和细胞间的紧密度等指标)，主观性很强。为提高全克隆判定标准的严谨性和实用性，本研究在明确全克隆源于肿瘤干细胞的实验基础上，加入阿霉素进行细胞毒性干预，观察全克隆细胞群体的耐药特性，旨在构建一种简单易行的肝癌干细胞体外富集模式。

1　材料与方法

1.1材料人肝母细胞瘤细胞系HepG2(加拿大UBC大学戴龙君教授惠赠)、胎牛血清和RPMI1640培养液(美国Gibco公司)、TRIzol(Invitrogen公司)、RNA逆转录试剂盒和引物(大连宝生物公司)、荧光定量Mix和八联管(罗氏公司)、mTeSRTM1人胚胎干细胞完全培养基(Stem Cell Technologies公司)、阿霉素(深圳万乐药业有限公司)。恒温CO2培养箱(日本三洋公司)、倒置显微镜(日本Olympus公司)、定量PCR仪(Roche480Ⅱ,罗氏公司)。Balb/C雄性裸鼠5～6周龄，体质量为18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2肝癌干细胞体外富集模式的构建及验证

1.2.1肝癌干细胞干性检测

1.2.1.1单个细胞全克隆形成及扩增培养取对数生长期HepG2细胞，制成单细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基以有限稀释法，接种于96孔板,平均每孔1个细胞,置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中,每天用倒置显微镜观察细胞生长情况。记录细胞数量，2周后观察单个细胞克隆形成情况,根据单细胞克隆形态分类,将克隆分为全克隆、部分克隆和旁克隆3类,判断标准参考Barrandon和Green对人表皮角质细胞的研究[4]。计算克隆形成率，克隆形成率=克隆总数/接种细胞数×100%。选取96孔板中的HepG2细胞的全克隆，培养14 d后胰酶消化转移至24孔板，待24孔板长至70%～80%，同法转移至6孔板，待6孔板长至70%～80%转移至培养瓶继续培养。

1.2.1.2细胞全克隆成瘤实验一组将不同孔号内的全克隆进行组合，细胞数量为1×104；另一组将单个细胞全克隆扩增培养至培养瓶长满，细胞计数为1×106，两组均以800 r/min离心5 min,弃掉上清,用RPMI1640培养基1 mL重悬,用1 mL注射器吸取细胞悬液。随机选取5～6周、体质量为18～22 g的Balb/C雄性裸鼠16只，右侧腋下皮下注射0.2 mL的1×104、1×106全克隆细胞各8只。每日观察裸鼠的精神、饮食、体质量，移植瘤形成后需测量瘤体直径。待瘤体直径达1.5 cm时处死裸鼠，移植瘤体置10%甲醛固定液中固定,石蜡包埋,常规病理切片及HE染色。

1.2.1.3细胞全克隆干细胞表面标志物mRNA检测采用qRT-PCR。取对数生长期HepG2细胞及典型的全克隆(同类型克隆组合)，调整细胞浓度为1×104/mL，吸取1 mL单细胞悬液至EP管中，2 000 r/min离心5 min，弃去上清。用TRIzol法提取总RNA并逆转录成cDNA。real-time PCR扩增条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、65 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40个循环。引物序列见表1。以β-actin为内参基因，根据实验所获Ct对各基因进行相对定量分析，实验重复6次，结果以2-ΔΔCt法表示。

1.2.1.4细胞全克隆悬浮球形成率计算取对数生长期的HepG2及其全克隆、部分克隆、旁克隆,胰酶消化成单个细胞，用配制好的mTeSRTM1人胚胎干细胞完全培养基重悬细胞,调整细胞密度为2 000个/mL。接种于低黏附96孔板,每孔100 μL，即每孔200个细胞,每一种细胞设10个复孔，每天观察细胞成球情况。3 d后向每孔加入含10% FBS的RPMI1640培养基80 μL。10 d后计算≥100个细胞的“球囊”数,计算悬浮球形成率。悬浮球形成率=球囊数/接种细胞数×100%。

表1　目的基因引物序列

1.2.2肝癌干细胞耐药特性检测取对数生长期HepG2单细胞培养形成全克隆，第12天分别加入含0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01 μg/mL浓度阿霉素的培养基，24 h后换液，48 h后改换不含阿霉素的正常培养基，其后观察2 d，观察全克隆生长情况。将完整存活的全克隆进行扩增培养，将持续扩增的全克隆进行裸鼠皮下荷瘤实验。

2　结果

HepG2单细胞培养均可形成全克隆、部分克隆、旁克隆细胞形态。从生长曲线可以看出，第7天以后全克隆增殖速度最快，细胞数量最大，部分克隆次之，旁克隆增殖最慢并于第10天开始出现细胞皱缩死亡。HepG2细胞克隆形成率为32.78%±9.03%，其中全克隆、部分克隆、旁克隆百分比分别为7.12%±2.96%、62.67%±13.39%、30.21%±14.87%。HepG2单个细胞于第14天形成全克隆，细胞排列规则、紧凑，边界光滑清晰；转至24孔板培养到第16天细胞成克隆团分布，后逐渐连接成片状生长；第22天转至6孔板后持续扩增，于第32天转至培养瓶，细胞呈铺路石状生长迅速，状态良好(图1)。1×104个HepG2细胞全克隆接种裸鼠成瘤率为12.5%(1/8),成瘤时间为接种后的第32天，第56天瘤体直径7.3 mm; 1×106个HepG2细胞全克隆接种裸鼠成瘤率为100%(8/8)，成瘤时间为接种后的第4～5天，第28天瘤体直径为(10.49±1.25)mm。与HepG2细胞相比，单细胞全克隆ABCG2、CD44、ALDH1A3、CXCR4和OCT4表达倍数分别为2.26±0.33、2.67±0.55、3.96±1.56、2.56±0.55、1.05±0.40，两者ABCG2、ALDH1A3、CD44、CXCR4相比,P均<0.05。在悬浮球形成实验中,只有HepG2细胞全克隆有悬浮球形成,其余细胞系不形成悬浮球,均于第3天开始逐渐皱缩死亡，全克隆悬浮球形成率为8.79%±5.62%。

图1　HepG2单个细胞培养形成的全克隆

HepG2细胞全克隆分别加入0.5、0.3、0.2 μg/mL阿霉素后48 h逐渐萎缩死亡，换正常培养基2 d后，几乎无细胞存活。HepG2细胞全克隆加入0.1、0.05、0.01 μg/mL阿霉素后，出现部分或少数细胞变圆变亮死亡，更换正常培养基后大部分全克隆细胞状态良好，转至24孔板后，细胞呈铺路石状生长迅速。加入0.1、0.05、0.01 μg/mL阿霉素HepG2细胞全克隆接种裸鼠成瘤率均为100%(5/5)，成瘤时间为接种后的第4～5天，第28天瘤体直径分别为(9.27±2.06)、(12.92±1.88)、(11.62±0.07)mm。

3　讨论

对于体外单细胞培养的细胞生长方式，早期的研究表明，皮肤的上皮细胞单个培养时，会形成全克隆、部分克隆和旁克隆3种生长形态，其中全克隆在二次克隆形成实验中大部分可以连续传代下去，只有<5%的细胞分化，被认为是富含干细胞的群体；而旁克隆面积小，构成细胞体型大且排列极不规则，在二次克隆形成实验中不能形成克隆；部分克隆介于全克隆和旁克隆之间，也因此认为部分克隆只有少量干细胞群存在，旁克隆则是基本为分化的细胞群，无干细胞[4]。因此，在同是源于上皮细胞组织的癌干细胞研究中，多位研究者在体外单细胞培养的基础上，发现乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、胰腺癌[7]和卵巢癌[8]等肿瘤的全克隆成瘤性很高，1×103个来源于全克隆的细胞就可使NOD/SCID鼠形成皮下移植瘤，但来源于部分克隆或旁克隆的细胞即使1×105个也无法成瘤[9]。本研究组前期研究也发现，肾上腺皮质癌也有类似的现象[10]，在本次研究中，将全克隆细胞的成瘤性实验接种对象更换为Bald/C裸鼠，1×104与1×106个细胞水平均可部分或全部成瘤，即在免疫功能明显强于NOD/SCID鼠的裸鼠体内也能成瘤，提示HepG2单细胞培养形成的全克隆富含肝癌干细胞。在无血清悬浮球培养实验中，HepG2全克隆细胞有悬浮球形成，另两种克隆细胞系均不形成悬浮球，并逐渐皱缩死亡。这提示HepG2全克隆细胞具有更强的肿瘤干细胞特性，即自我更新及增殖能力，可以在无血清的培养条件下成球状生长。进一步检测发现，HepG2全克隆细胞中肿瘤干细胞相关标志物ABCG2、CD44、ALDH1A3、CXCR4表达水平显著升高，而OCT4则与旁克隆与部分克隆无显著差异，其中CD44、CXCR4分子标志与癌细胞的转移密切相关[11,12]。ABCG2是典型的耐药蛋白[13]，可见HepG2全克隆细胞具有更强的侵袭性和耐药性，这也与肿瘤干细胞特性是一致的。因此，肝癌HepG2细胞体外单细胞培养形成的全克隆极可能富含癌干细胞。

在单细胞培养形成全克隆的具体判定中，全克隆的标准主要是克隆面积为10～30 mm2，含有(2～5)×104个细胞，克隆结构紧凑且边界光滑，形状规则多为圆形，克隆内细胞体积小且排列紧密[4]。这都是初步的形态学标准，容易受不同评判观察者主观因素的影响，因此，在研究中增加了观察全克隆耐药特性的干预实验，选用细胞毒性的周期非特异性化疗药物阿霉素[14]，干细胞ABCG2等耐药蛋白可以泵出阿霉素，显示其抗药特性。本研究结果发现，实验所选的HepG2全克隆可以耐受较高的阿霉素浓度(0.1 μg/mL)，能够维持其生长活性和较强的成瘤特性，而该浓度阿霉素可以基本抑制普通培养体系中的HepG2细胞生长活性，导致大部分细胞死亡。说明体外单细胞培养的HepG2全克隆细胞群体可耐受阿霉素杀伤，极有可能是富含肝癌干细胞群体。因此，在对单个癌细胞培养形成的全克隆判定后再进行阿霉素等化疗药物干预，这可能是简单有效改良型体外肿瘤干细胞富集模式，可为肿瘤干细胞的研究提供细胞学实验基础。

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Establishment of enrichment pattern of hepatocellular carcinoma stem cells in vitro

YANGShuai1,CHENJuan,SHEZuoya,CHENXiangyi,CAIJie,KUANGXiaocong

(1Departmentofdathophysiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To establish the enrichment pattern of hepatocellular carcinoma stem cells in vitro. Methods The hepatoblastoma cell line HepG2 was selected to establish the system of single-cell colony formation by limiting dilution in vitro, and we observed the growth curve of single-cell clones in vitro and the formation ratio of holoclone (Holo), meroclone (Mero) and pareclone (Pare). The holoclones were selected to amplify and then the 1×104and 1×106hepatocellular carcinoma cells were inoculated subcutaneously in nude mice. The mRNA expression of CSC markers (ABCG2, ALDH1A3, OCT4, CD44 and CXCR4) was detected by qRT-PCR. Sphere formation ratio of the holoclones was detected by tumor cell sphere culture. After holoclones were intervented by 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 and 0.01 μg/mL adriamyc for 48 h, we observed the growth of holoclones. For the survival holoclones after intervention, all progressive amplification and inoculation subcutaneously in nude mice were conducted. ResultsThe clone formation rate of HepG2 cells was 32.78%±9.03%, among which the percentage of holoclones was 7.12%±2.96%, the percentage of meroclones was 62.69%±13.39%, and the percentage of pareclones was 30.21%±14.87%. All the holoclones could be amplified and the tumor formation rates in the 104 and 106 HepG2 cells in nude mice were respectively 12.5% and 100%. Compared with HepG2 cells, the times of ABCG2, CD44, ALDH1A3, CXCR4 and OCT4 expression in the holoclones were 2.26±0.33, 2.67±0.55, 3.96±1.56, 2.56±0.55 and 1.05±0.40. Significant difference was found between ABCG2, ALDH1A3, CD44 and CXCR4 (allP<0.05). Only HepG2 holoclones could form suspension sphere. After the single cell clone culture, the holoclones were intervened by adriamyc, only HepG2 holoclones intervened by 0.1, 0.05 and 0.01 μg/mL adriamyc were survival, and the tumor formation rate in nude mice was 100%. Conclusion The enrichment pattern of liver cancer stem cells is successfully constructed in vitro.

cancer stem cells; hepatocellular carcinoma stem cells; holoclone; cell culture

广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019244)。

杨帅(1987-)，女，硕士，主要从事癌干细胞的特性及富集分离方法的研究。E-mail: 785322903@qq.com

简介：邝晓聪(1970-)，男，副教授，主要从事癌干细胞及免疫抑制剂的研发。E-mail: 13617715826@139.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.001

R73

A

1002-266X(2016)23-0001-04

2015-11-25)