葛嫣然，邵宏超，王福海

(1华北理工大学附属医院，河北唐山 063000；2河北青县人民医院)



雌激素皮下注射对兔视网膜缺血再灌注损伤的预防作用

葛嫣然1，邵宏超1，王福海2

(1华北理工大学附属医院，河北唐山 063000；2河北青县人民医院)

目的观察雌激素对兔视网膜缺血再灌注损伤的预防作用。方法55只雄性健康纯种大耳白兔，将其随机分为正常假手术组(5只)、缺血组(25只)、治疗组(25只)。治疗组皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d；缺血组给予等量生理盐水皮下注射7 d。缺血组与治疗组制备视网膜缺血再灌注损伤模型，正常假手术组仅进行前房穿刺。观察缺血组与治疗组再灌注后3、6、12、24、72 h及正常假手术组视网膜病理形态学变化，免疫组织化学SABC法测算其视网膜组织中bax的阳性细胞数。结果治疗组再灌注后3、6、12、24、72 h视网膜水肿、细胞空泡变性等改变均较缺血组轻，视网膜bax阳性细胞数均较缺血组少(P均<0.05)。结论雌激素对兔视网膜缺血再灌注损伤有预防作用，其机制可能为下调bax表达。

视网膜；缺血再灌注损伤；苯甲酸雌二醇；bax蛋白；细胞凋亡

在临床上，视网膜缺血损伤超过90 min，视网膜功能将永久受损。研究[1]发现，5～10 min的缺血后再灌注已可造成视网膜细胞的明显凋亡。研究证明，凋亡是视网膜缺血再灌注损伤中神经细胞死亡的主要形式，而bax为重要的凋亡调控基因。雌激素可通过清除自由基、抗氧化、抗神经凋亡减少缺血再灌注损伤，减少缺血性心脑血管病和视网膜中央静脉阻塞的发生[2～4]。本实验通过建立兔视网膜缺血再灌注损伤模型，观察了雌激素对兔视网膜缺血再灌注损伤的预防作用。

1　材料与方法

1.1实验动物及试剂55只健康纯种大耳白兔，体质量(3.0±0.2)kg，雄性，外眼及眼底检查均正常，室温环境饲养。苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)，bax抗体(武汉博士德生物工程公司)，SABC试剂盒(即用型)购自武汉博士德生物工程公司，HE染色试剂由本院病理教研室提供。

1.2兔视网膜缺血再灌注损伤模型制备及雌激素用法实验分为正常假手术组(5只)、缺血组(25只)、治疗组(25只)。治疗组皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d。缺血组给予等量生理盐水皮下注射7 d。缺血组与治疗组采用升高眼内压方法制备视网膜缺血再灌注损伤模型，正常假手术组仅进行前房穿刺。正常假手术组前房穿刺后即处死，缺血组与治疗组在再灌注后3、6、12、24、72 h各处死5只兔，用于下述实验。

1.3视网膜病理形态学观察方法摘除兔眼球,置于4%多聚甲醛固定24 h,去除眼前节组织,后段眼环再固定4 h，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，包埋，切片。切片HE染色，光镜显微镜下观察视网膜病理形态学变化。

1.4视网膜bax蛋白检测采用免疫组织化学SABC法检测兔视网膜bax蛋白，将切片常规脱蜡后热修复抗原，滴加H2O2灭活内源性酶,滴加山羊血清封闭液封闭。依次加入抗bax抗体(鼠抗兔IgG)、生物素化山羊抗鼠IgG、SABC、DAB显色液，苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察，细胞质染成棕黄色为蛋白阳性表达。在视网膜切片中央部位向两侧各取两个连续不重叠的高倍视野，计数每个视野阳性细胞数，以平均数作为每张切片阳性细胞数。

2　结果

正常假手术组视网膜内界膜平滑完整，三层细胞分界清楚，节细胞呈单层排列，按细胞核大小分为两类：一类大核浅染；另一类小核深染，核内染色质分布均匀。内、外核层细胞均呈多层排列，其厚度、染色均匀，细胞排列整齐紧密。缺血组缺血再灌注损伤后24 h可见各层细胞排列疏松，细胞间隙增大，神经纤维层轻度肿胀；伤后24～72 h，视网膜水肿，部分细胞空泡样变，视网膜神经节细胞数量减少。治疗组伤后24 h，视网膜各层细胞排列稍显疏松，细胞间隙略增大，伤后24～72 h，视网膜水肿相对较轻，少量细胞空泡变性等改变，视网膜神经节细胞数量轻度减少。治疗组视网膜在再灌注后3、6、12、24、72 h的病理改变均较缺血组明显减轻。缺血组、治疗组视网膜bax阳性细胞数比较结果见表1。

表1　缺血组、治疗组视网膜bax阳性细胞数比较(个

注：与缺血组同时点比较，*P<0.05。

3　讨论

雌激素是一类重要的类固醇激素，可促进女性生殖器官成熟，维持女性特征和生殖系统活动。在中枢神经系统及骨组织中也发挥着重要作用，与视网膜血管生成调控、视网膜缺血再灌注损伤、眼底恶性肿瘤及老年性黄斑变性等眼部生理及病理过程有密切关联[5]。Nonaka等[6]在大鼠视网膜缺血再灌注损伤实验中发现，雌激素可以减少白细胞在缺血视网膜内聚集，从而减轻再灌注时神经组织损伤。Zhou等[7]在继发性青光眼的实验中发现，雌激素可通过抑制细胞凋亡减少神经节细胞及神经纤维丢失。代艳等[8]发现雌激素可以减轻治疗组视网膜内层萎缩变性程度，使神经节细胞凋亡数量减少。Russo等[9]在大鼠急性眼压升高模型的实验中发现，雌激素可减少由高眼压导致的视网膜神经节细胞的凋亡。王建平等[10]在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型实验中发现，17β-雌二醇可以通过升高凋亡抑制基因bcl-2的表达，减少脑缺血再灌注损伤细胞的凋亡。

本研究采用HE染色观察视网膜组织形态学变化，发现治疗组再灌注后各时间点视网膜病理改变均较缺血组明显减轻，提示雌激素能够减轻视网膜缺血再灌注损伤，对维持视网膜功能、保护视网膜细胞有重要的治疗作用。bax是神经细胞调亡的重要调节因子，基因位于染色体19q13.3-19q13.4，含有6个外显子。研究表明，bax在神经系统损伤后表达增强，说明bax在神经损伤后视网膜神经节的继发性死亡中起重要作用。通过对凋亡相关基因的研究发现，bax、bcl-2、bcl-xs、bad、bag-1具有同源性，bax和bcl-2可以分别以同源二聚体存在，也可以形成异源二聚合体。bcl-2是一种抗氧化剂，它不能改变内源性过氧化物产生的速度，但能完全阻止脂质过氧化，保护细胞免受H2O2等诱导的凋亡。本实验中缺血组及治疗组视网膜中可见bax阳性细胞表达，缺血组bax阳性细胞在再灌注3 h即有表达，6 h已较显著，24 h达到高峰，72 h仍有所表达；雌激素治疗组阳性细胞出现时间较缺血组晚，且表达明显低于缺血组。此研究结果表明，雌激素能抑制bax基因的表达从而抑制细胞凋亡。

综上可见，雌激素对兔视网膜缺血再灌注损伤有预防作用，其机制可能为下调bax表达。

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唐山市科技计划项目(12140209A-47)。

邵宏超(E-mail: shaohongchao@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.016

R774.1

A

1002-266X(2016)23-0050-02

2015-10-29)