岳龙，贺涛，张玲,韩树峰

(1山西医科大学第一临床医学院，太原 030000；2郑州大学附属肿瘤医院)



三氧化二砷对人骨肉瘤细胞系MG-63迁移、黏附能力的影响

岳龙1，贺涛2，张玲2,韩树峰1

(1山西医科大学第一临床医学院，太原 030000；2郑州大学附属肿瘤医院)

目的观察三氧化二砷对人骨肉瘤细胞系MG-63迁移、黏附能力的影响。方法 常规培养人骨肉瘤细胞系MG-63，将其分为实验组(加入浓度为1.0 μmol/L的三氧化二砷)、阳性对照组(加入15 mg/L的5-FU)、阴性对照组(加入同体积的的培养液)。细胞聚集实验方法检测细胞同质黏附能力,用层黏蛋白实验来观察细胞的异质黏附能力，用划痕实验及Transwell小室法检测细胞趋化迁移能力。结果实验组在振摇时间20、40、60 min时的细胞聚集指数分别为0.24±0.030、0.46±0.060、0.59±0.070，阳性对照组分别为0.16±0.012、0.20±0.024、0.33±0.022，阴性对照组分别为0.14±0.011、0.18±0.015、0.22±0.023，实验组与阳性对照组、阴性对照组相比，P均<0.05。实验组在培养60、90 min时的OD值分别为0.144±0.007、0.141±0.013，阳性对照组分别为0.363±0.035、0.513±0.034，阴性对照组分别为0.387±0.026、0.461±0.024，实验组与阳性对照组、阴性对照组相比，P均<0.05。实验组迁移距离、迁移面积及迁移速率分别为(192.3±16.7)μm、(91.9±9.1)×103μm2、(4.00±0.35)μm/h，阳性对照组分别为(301.6±23.8)μm、(161.9±12.9)×103μm2、(6.9±0.9)μm/h，阴性对照组分别为(362.0±27.8)μm、(242.5±21.2)×103μm2、(8.2±1.1)μm/h，实验组与阳性对照组、阴性对照组相比，P均<0.05。实验组、阳性对照组、阴性对照组迁移跨膜细胞数分别为(112±11)、(172±15)、(276±37)个，两两组间比较，P均<0.05。结论三氧化二砷在体外能显著增加人骨肉瘤细胞系MG-63同质之间的黏附能力而抑制骨肉瘤细胞与基质的黏附能力，并且抑制骨肉瘤细胞的趋化迁移。

三氧化二砷；骨肉瘤；细胞迁移；细胞黏附

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，又称成骨肉瘤，其以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征，占原发恶性骨肿瘤的20%，是骨骼系统最常见的原发恶性骨肿瘤，70%～80%的患者发病于青少年，年发病率为(1～3)/100万。骨肉瘤常无典型临床症状，容易与外伤或生长痛混淆，恶性程度高，早期极有可能发生肺转移。目前常采用综合治疗的方式，外科手术治疗辅以术前后化疗，但术后易复发，而化疗总体有效率仅为60%左右。因此，改善预后的关键除要早期诊断早期治疗外，更重要的是寻找有效的治疗措施。三氧化二砷已被研究证实具有诱导细胞分化、凋亡及细胞毒作用，最早运用于治疗急性早幼粒细胞性白血病。近来许多实验和临床研究也证实，三氧化二砷对抑制骨肉瘤增殖及促进骨肉瘤凋亡有一定的抑制作用。本研究观察了三氧化二砷对人骨肉瘤细胞系MG-63迁移、黏附的影响。

1　材料与方法

1.1材料人骨肉瘤细胞系MG-63购自上海中科院细胞库；RPIM1640培养液干粉及小牛血清由河南省肿瘤医院张玲教授馈赠(购自美国英骏生物技术有限公司)；Transwell小室购自corning公司(美国)；三氧化二砷购自郑州安赛生物科技有限公司。

1.2细胞培养人骨肉瘤细胞系MG-63，用含10%的小牛血清RPIM1640培养基(含100 mg/L青霉素及链霉素)置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养备用。

1.3三氧化二砷对人骨肉瘤细胞系MG-63黏附的影响观察①细胞同质黏附能力检测：采用细胞聚集实验。将24孔板用1%BSA 4 ℃包被过夜。取对数期生长的人骨肉瘤细胞系MG-63，用HCMF(10 mmol/L HEPES、0.137 mol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、0.34 mmol/L Na2HPO4·12H2O、0.1% glucose)洗涤细胞两次，0.05%胰蛋白酶消化。HCMF再次洗涤一次，使细胞悬浮在HCMF溶液中，计数细胞，调节细胞浓度为2×105。按500 μL细胞悬液/孔加入到1% BSA包被好的24孔培养板，加入Ca2+使之终浓度为1 mmol/L，实验组加入1 mL浓度为1.0 μmol/L的三氧化二砷，阳性对照组加入1 mL浓度为15 mg/L的5-FU，阴性对照组加入1 mL的培养液。将培养板放置在空气振荡器上，80 r/min分别振摇20、40、60 min后显微镜下统计聚集细胞数及单个细胞数。通过计算细胞聚集指数(AI)来衡量细胞黏附能力，AI=(N0-Nt)/N0，其中N0为聚集实验开始前统计细胞数(包括单个细胞与聚集细胞)，Nt为特定时间后总细胞数(包括单个细胞与聚集细胞)，三组均独立实验重复3次。②细胞异质黏附能力检测：采用层黏蛋白实验。选用96孔培养板，三组细胞分别选用5个复孔，均用层黏连蛋白Ln进行包被，胰酶消化骨肉瘤细胞，然后将骨肉瘤细胞等量加入每个孔，每个孔的细胞数为1×106个。在室温、5%CO2条件下，实验组加入1 mL浓度为1.0 μmol/L的三氧化二砷，阳性对照组加入1 mL浓度为15 mg/L的5-FU，阴性对照组不做处理。静置培养，30 min后各取出一孔，将未黏附的骨肉瘤细胞快速去除，用Cell Counting Kit-8试剂盒避光染色三组细胞，2 h后，分别计算在490 nm处三组各孔骨肉瘤细胞的OD值,然后在培养60 min和培养90 min时重复上述步骤。独立实验重复3次取平均值。

1.4三氧化二砷对人骨肉瘤细胞系MG-63迁移的影响观察 ①划痕实验检测细胞迁移：取对数生长期的骨肉瘤细胞，胰酶消化，以细胞1×106每孔接种6孔板。在不含血清的DMEM中培养24 h，实验组加入1 mL浓度为1.0 μmol/L的三氧化二砷，阳性对照组加入1 mL浓度为15 mg/L的5-FU，阴性对照组加入1 mL的培养液。用细胞刮刀于培养板底部划出4条长500 μm、宽650 μm平行垂直的划痕，48 h后拍照，Adobe Photoshop CS3分析其迁移距离、迁移面积及迁移速率。②Transwell小室检测细胞趋化迁移：Transwell小室放入24孔培养板，形成上下两个小室。胰酶消化细胞，重悬于无血清0.5% BSA-DMEM培养基。调节细胞为1×106/mL，取100 μL细胞悬液加入Transwell上层小室，下层小室加胎牛血清培基作趋化因子。实验组在上层小室内加入1 mL浓度为1.0 μmol/L的三氧化二砷，阳性对照组在上层小室内加入1 mL浓度为15 mg/L的5-FU，阴性对照组不做处理。继续培养24 h后，将各组Transwell膜以甲醇固定，结晶紫染色。洗脱膜表面的细胞并用中性树胶封闭于玻片中。镜下观察穿膜细胞并拍照，随机选取5～8个视野计数并统计。

2　结果

三组细胞振荡不同时间后AI比较见表1。三组细胞孵育不同时间后OD值比较见表2。实验组细胞于镜下可见大量的细胞团块状组织，阳性对照组可见少量的细胞团块组织，而阴性对照组可见大量散在的细胞及极少的小细胞团块。三组细胞划痕实验迁移面积、迁移距离、迁移速率比较见表3。实验组、阳性对照组、阴性对照组迁移跨膜细胞数分别为(112±11)、(172±15)、(276±37)个，两两组间比较，P均<0.05。

表1　振荡不同时间后三组细胞AI比较( ±s)

注：与阳性对照组、阴性对照组相比，*P<0.05。

表2　孵育不同时间后三组细胞OD值比较±s)

注：与阳性对照组、阴性对照组相比，*P<0.05。

表3　　　　三组细胞划痕实验迁移面积、迁移距离、迁移速率比较

注：与阳性对照组、阴性对照组相比，*P<0.05。

3　讨论

骨肉瘤是儿童及青少年常发的恶性肿瘤，临床常用抗癌药物有阿霉素、顺铂和环磷酰胺等，常单用或合用。近年来新辅助化疗的出现显著提高了患者的生存率，但肿瘤发生转移和复发率仍较高，并很容易形成耐药。因此，需要寻求新的单纯应用或联合应用的化疗药物。三氧化二砷是无机剧毒品，既往研究[1]发现其治疗急性早幼粒细胞白血病临床效果显著。体外实验发现，三氧化二砷对恶性淋巴瘤、胃癌[2]、肝癌[3]、胆囊癌、肺癌[4]、宫颈癌[5]等多种恶性肿瘤细胞的增殖均有抑制作用。对尤文肉瘤[6]及转移性骨肿瘤[7]也有明显抑制作用。三氧化二砷抗肿瘤作用的机制可能主要有：①可能存在诱导或促进肿瘤细胞的凋亡作用[8]。三氧化二砷可能因自身的毒性作用作用于癌细胞自身的凋亡基因干扰或阻止了癌细胞的无限增殖途径。目前研究发现，三氧化二砷对肿瘤细胞增殖的抑制强度主要可能和其浓度有关。②抑制肿瘤细胞端粒酶的活性[9]。三氧化二砷作用于裸鼠移植性肝癌以及急性早幼粒细胞株后，肿瘤细胞的端粒酶活性有不同程度的下降，且下降的程度和三氧化二砷的作用时间和浓度呈正相关。③抑制肿瘤血管生成[10]。④阻滞细胞周期[11]。三氧化二砷能将多种肿瘤细胞株阻滞在G1/S和G2/M期。⑤细胞毒作用[12]。三价砷具有很强的毒性，三价砷可能与细胞的某些抗氧化酶结合使其失去活性，影响细胞的DNA合成和修复，进而导致细胞凋亡。骨肉瘤早期极易发生远处转移，转移途径主要有以下几个步骤：①骨肉瘤细胞间黏附能力降低而骨肉瘤细胞与异质间的黏附能力增强，瘤细胞与细胞外的某些基质结合脱离原发部位。②脱离原发部位后，癌细胞分泌水解酶水解细胞外基质，形成游离状态。③游离的癌细胞黏附于组织细胞、淋巴液、血液进入血管或淋巴管，进而向全身远处转移。本研究采用细胞聚集实验及Ln黏附实验分别检测了经三氧化二砷作用后骨肉瘤同质及异质黏附能力的变化，结果发现经三氧化二砷作用后细胞同质黏附能力显著增加，而同Ln的黏附显著降低，这说明了三氧化二砷抑制骨肉瘤侵袭的机制可能包括增加细胞同质黏附而抑制其异质黏附。细胞迁移能力与癌细胞的侵袭能力呈正相关。本研究采用细胞划痕法证明，细胞经三氧化二砷作用后骨肉瘤细胞的迁移面积、迁移距离、迁移速率低于对照组。Transwell小室结果表明，细胞经三氧化二砷作用后骨肉瘤穿膜细胞数显著低于对照组。这说明三氧化二砷抑制骨肉瘤细胞侵袭的机制还可能包括抑制细胞的趋化迁移。

可见，三氧化二砷在体外能显著增加人骨肉瘤细胞系MG-63同质之间的黏附能力而抑制骨肉瘤细胞与基质的黏附能力，并且抑制骨肉瘤细胞的趋化迁移。三氧化二砷在骨肿瘤的应用越来越多，目前对四肢骨骼恶性肿瘤的治疗方法主要是以新辅助化疗为基础的保肢手术，三氧化二砷应用的各种剂型不断涌现，作为一种化疗药的同时又是化疗增敏剂，局部应用于病灶清除后，配合全身化疗，不仅能提高局部有效药物浓度，还能减少化疗药物总剂量，降低毒副作用。

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2015-12-25)