刘辉，刘宇飞，李向东，杨初蔚

(大连医科大学附属第二医院，辽宁大连 116023)



Toll样受体4抑制剂C34灌服对大鼠脓毒症急性肺损伤的治疗作用及其机制探讨

刘辉，刘宇飞，李向东，杨初蔚

(大连医科大学附属第二医院，辽宁大连 116023)

目的观察Toll样受体4抑制剂C34对大鼠脓毒症急性肺损伤的治疗作用，并探讨其可能机制。方法将大鼠随机分为假手术组1、模型组1、C34治疗组1和C34治疗组2，每组10只。模型组1、C34治疗组1、C34治疗组2制备脓毒症急性肺损伤模型，C34治疗组1和C34治疗组2于造模成功后1、8 h，分别予灌服1 mg/kg和2 mg/kg的C34治疗。比较各组肺组织湿/干重，肺损伤病理评分，肺组织IκBα、p65、cleaved-caspase 3蛋白表达量，肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达量。结果与假手术组1相比，模型组1肺湿/干重、病理评分、p65蛋白、cleaved-caspase 3蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表达高，IκBα蛋白表达低(P均<0.05)。与模型组1相比，C34治疗组1、C34治疗组2肺湿干重比、病理评分、p65蛋白、cleaved-caspase 3蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表达低，IκBα蛋白表达高，且C34治疗组2较C34治疗组1变化明显(P均<0.05)。结论C34灌服对大鼠脓毒症急性肺损伤有治疗作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。

Toll样受体4抑制剂；C34;脓毒症；肺损伤

脓毒症肺损伤是导致危重脓毒症患者死亡的重要原因[1,2]，但临床尚缺乏特异性治疗药物。以往研究[3]发现，Toll样受体(TLR)4在脓毒症所致肺损伤的病情发展中发挥重要作用，敲除TLR4基因或者靶向抑制TLR4的表达可以显著减轻急性肺损伤的程度[4,5]。C34是TLR4的新型抑制剂[6]，本研究观察了C34灌服对大鼠脓毒症急性肺损伤的治疗作用，并探讨其可能机制，以期为临床脓毒症患者的治疗提供新的思路和方法。

1　材料与方法

1.1实验动物、试剂及仪器雄性SD大鼠120只，体质量220～240 g，购自大连医科大学实验动物中心。cleaved-caspase 3、IκBα和β-actin的抗体购自美国cell signaling公司，p65和组蛋白3(H3)抗体购自美国Abcom公司，IL-6、IL-1β和TNF-α试剂盒购自杭州联科生物公司，C34购自美国Tocris公司，核蛋白和总蛋白的提取试剂盒均购自南通碧云天生物技术公司。

1.2脓毒症急性肺损伤模型制备和C34用法脓毒症急性肺损伤模型的建立采用大鼠盲肠结扎穿刺术法。使用水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)将大鼠麻醉后，剔除腹部毛发，碘伏和乙醇消毒，沿前腹正中线作一长3 cm的切口，从腹腔中将盲肠取出，四号线于盲肠距离盲端1.5 cm处进行结扎，然后采用18号针头在盲肠结扎处远端穿刺两次，挤出少许肠内粪便后，回纳盲肠入腹腔，逐层缝合关腹。手术完成后，腹腔注射生理盐水以补充术中体液丢失，补充剂量为24 mL/kg。将大鼠放置在保温毯上保温至苏醒，待其苏醒后放于鼠笼中，自由进食饮水。本研究分两部分，在实验一中，将大鼠采用随机数字法随机分为假手术组1、模型组1、C34治疗组1和C34治疗组2，每组10只；在实验二中，将大鼠采用随机数字法分为假手术组2、模型组2、C34治疗组3、C34治疗组4，每组20只，所有大鼠术前禁食12 h。假手术组1、假手术组2仅作盲肠探查术处理，模型组1、模型组2、C34治疗组1、C34治疗组2、C34治疗组3、C34治疗组4制备脓毒症急性肺损伤模型。C34治疗组1和C34治疗组2于造模成功后1、8 h，分别予灌服1 mg/kg和2 mg/kg的C34治疗。实验一于模型制备后24 h处死大鼠，取出肺组织,待测。C34治疗组3、C34治疗组4造模成功后1、24、48、72、96 h分别给予灌服1 mg/kg和2 mg/kg的C34治疗，观察各组大鼠5 d病死率。

1.3肺组织湿/干重计算将大鼠左肺两叶取出后，迅速用吸水纸吸干肺表面水分和血液，电子天平称湿重，置入80 ℃烘箱内烘24 h后，再称重获得干重，用计算所得肺组织湿/干重来评价肺组织的水肿程度。

1.4肺组织病理学检查取右肺下叶置于组织专用包埋盒后立即置入4%多聚甲醛溶液中固定，用作病理HE染色。肺组织的病理损伤程度由两位病理科医师采用双盲法进行评估，对每张切片随机选择8个高倍视野(×400)进行观察，显微镜下急性肺损伤判定标准为中性粒细胞浸润、间质水肿、出血、透明膜形成、坏死和充血。肺损伤严重度评分标准[7]：正常为0分；极轻度(<25%)为1分；轻度(25%～50%)为2分；中度(50%～75%)为3分；重度(>75%)为4分。将两位病理科医生统计后的平均分后作为大鼠肺损伤的最终病理评分。

1.5肺组织IκBα、p65和cleaved-caspase 3蛋白检测采用免疫印迹法。右肺中叶核蛋白和总蛋白的提取分别采用核蛋白提取试剂盒和总蛋白提取试剂盒，提取的核蛋白用于p65和H3的检测，提取的总蛋白用于cleaved-caspase 3、IκBα和β-actin的检测，将提取的蛋白上清液按4∶1比例加入5×loading buffer沸水中煮10 min。每孔加入35 μg蛋白进行电泳，转膜后，5%牛奶封闭室温下1 h，一抗稀释液(均为1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，二抗稀释液室温下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加显影液，显影并使用胶片曝光，Image J软件进行定量分析。

1.6肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6检测采用酶联免疫吸附法检测肺组织中的TNF-α、IL-1β和IL-6，操作步骤严格按照说明书进行。

2　结果

假手术组1、模型组1、C34治疗组1和C34治疗组2肺湿/干重分别为4.5±1.1、8.3±3.1、7.1±2.8、5.2±2.1，病理评分分别为(0.10±0.01)、(3.90±0.20)、(2.70±0.11)、(1.20±0.09)分，假手术组1、C34治疗组1、C34治疗组2与模型组1相比，C34治疗组1与C34治疗组2相比，P均<0.05。各组肺组织IκBα、P65、cleaved-caspase 3蛋白表达比较见表1。各组肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达比较见表2。假手术组2、模型组2、C34治疗组3、C34治疗组4大鼠5 d病死率分别为5%、65%、50%、30%，假手术组2、C34治疗组3、C34治疗组4与模型组2相比，C34治疗组3与C34治疗组4相比，P均<0.05。

表1　　　　各组肺组织IκBα、p65、Cleaved-caspase 3

注：与模型组1相比，#P<0.05；与C34治疗组1相比，&P<0.05。

3　讨论

TLR4是一种跨膜蛋白，在结构上由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，TLR4信号通路向下游传导主要包括MyD88非依赖性和MyD88依赖性两条信号通路，前者不依赖于MyD88蛋白的激活作用，主要通过IRF-3和延迟的NF-κB反应；后者主要通过MyD88的激活，NF-κB从而快速反应，NF-κB激活后可以调控下游促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6等的表达[8]。以往大量研究[9～11]表明，TLR4在脓毒症肺损伤的发生和发展中发挥重要的作用，TLR4可以成为脓毒症治疗的药物作用靶点。然而，尽管一些TLR4的靶向抑制剂如瑞沙拖维已经进入到脓毒症的临床三期实验，但最终结果仍以失败告终[12]。因此本研究探讨了TLR4的新型抑制剂C34灌服在脓毒症肺损伤大鼠模型中的治疗作用及可能机制，以期为其进入临床试验打下坚实的理论基础。

表2　各组肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达比较

注：与模型组相比，#P<0.05；与C34治疗组1相比，&P<0.05。

最新研究[6,13]发现，C34在小鼠体内有显著的抗炎作用，但其在脓毒症大鼠肺组织损伤中的作用目前研究较少。本研究发现，1 mg/kg C34可以显著改善肺组织的病理损害程度，且2 mg/kg C34可以更进一步改善肺组织的病理损害程度，表明C34对肺组织的保护作用呈剂量依赖性。TLR4激活后通过胞内信号级联反应，进一步调控NF-κB的活性。NF-κB是机体内炎症反应的关键调节因子，在静息状态下，NF-κB p65主要与抑制性亚单位IκBα结合存在于胞质中，当细胞受到外界刺激时，IκBα发生泛素化降解，丧失对p65的束缚能力，脱离IκBα束缚的p65由胞质转到胞核，并与特定的靶基因序列结合，调节大量炎症因子的产生[14]。本研究发现，C34可以有效增加IκBα的表达量，显著减少脓毒症大鼠肺组织核内NF-κB p65蛋白和凋亡关键执行蛋白cleaved-caspase 3蛋白的表达，这可能是C34有效减少肺组织损伤的机制之一。此外，在证实C34可以抑制p65的核内转位后，本研究进一步探讨了C34对受NF-κB调控的炎症因子IL-6、IL-β和TNF-α表达的影响，结果表明C34可以显著抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表达。炎症因子是引起肺泡上皮和毛细血管屏障损伤进而导致肺水肿及透明膜形成的主导机制，本研究进一步探讨了C34对肺水肿的改善作用，发现C34可以显著减轻肺组织的水肿程度，且呈剂量依赖性。综合以上研究，我们推测C34可能通过抑制NF-κB信号通路，从而进一步下调下游相关炎症因子的表达来发挥肺组织的保护作用。此外，本研究还发现C34治疗大鼠的生存率较模型组显著升高，且2 mg/kg的C34治疗高于1 mg/kg的C34治疗，提示C34可能具有良好的临床应用价值，未来需要在临床一期实验中进一步去验证。

综上所述，C34灌服对大鼠脓毒症急性肺损伤有治疗作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。

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Effects of Toll-like receptor 4 inhibitor C34 on sepsis-induced lung injury of rats

LIUHui,LIUYufei,LIXiangdong,YANGChuwei

(TheSecondHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116023,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Toll-like receptor 4 inhibitor C34 on sepsis-induced acute lung injury (ALI) in rats, and to explore its possible mechanisms. MethodsMale SD rats were randomly divided into four groups, 10 in each group: the sham group 1, model group 1, C34 treatment groups 1 and 2. The sepsis-induced acute lung injury models were established in the model group 1, C34 treatment groups 1 and 2. Rats in the C34 treatment groups 1 and 2 were respectively treated with 1 mg/kg C34 and 2 mg/kg C34 at 1 h and 8 h after successful modeling. The lung wet/dry weight (W/D) ratio and pathologic scores were compared as well as the protein expression of IκBα, p65 and cleaved-caspase 3 and the expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Results Compared with the sham group 1, the lung W/D ratio, the pathological scores, the protein expression of p65, cleaved-caspase 3, TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased, and the protein expression of IκBα was decreased in the model group 1 (allP<0.05). Compared with the model group 1, the lung W/D ratio, the pathological scores, the protein expression of p65, Cleaved-caspase 3, TNF-α, IL-1β and IL-6 were decreased, and the protein expression of IκBα was increased in the C34 treatment group 1 and C34 treatment group 2, meanwhile, the changes in the C34 treatment group 2 were more significant as compared with those of the C34 treatment group 1 (allP<0.05).ConclusionC34 has therapeutic effect on sepsis-induced ALI rats, and this effect can be attributed to C34 ability of inhibiting NF-κB-mediated inflammatory response.

sepsis; lung injury； Toll-like receptor

辽宁省优秀人才培育项目(2014023018)。

杨初蔚(E-mail： esquire@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.014

R563

A

1002-266X(2016)23-0000-00

2015-12-09)