王 海，郑 璐，汤新星，陈永强，周忠海，陈复兴

（1.江苏大学附属人民医院核医学科，江苏镇江212002；2.中国人民解放军第九七医院中心实验室，江苏徐州221004）

TWS119对人NK细胞增殖和杀伤甲状腺癌BCPAP细胞的影响

王 海1，郑 璐2，汤新星1，陈永强2，周忠海2，陈复兴2

（1.江苏大学附属人民医院核医学科，江苏镇江212002；2.中国人民解放军第九七医院中心实验室，江苏徐州221004）

目的 探讨糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119对NK细胞增殖和杀伤功能的影响。方法 从健康人外周血中分离单个核细胞（PBMCs），加入到NK完全培养基培养，分别于第1d和第7d时，加入TWS119（0～8.0μmol/L）诱导培养。培养10 d后，用CCK-8法测定NK细胞增殖和杀伤甲状腺癌BCPAP细胞的能力；采用流式细胞术检测各组NK细胞纯度、颗粒酶和穿孔素的表达。结果 培养10d后，第1天加入TWS119诱导组对NK细胞纯度和增殖呈现抑制作用；而第7天加入在一定浓度范围的TWS119诱导培养时能促进NK细胞的增殖和杀伤指标穿孔素的表达及对甲状腺癌BCPAP细胞的体外杀伤活性。结论 TWS119在一定浓度范围能促进γδT细胞增殖和增强对甲状腺癌BCPAP细胞的杀伤功能。

NK细胞； TWS119； 细胞增殖； BCPAP细胞； 穿孔素

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，但近年来其发病率逐年走高，特别是乳头状细胞癌，临床可占总病例的60%～70%左右［1］。目前常见的治疗方法包括手术结合放射碘治疗和甲状腺激素抑制治疗，但是这些治疗方法易产生并发症和抗性的问题。近年来肿瘤细胞免疫治疗成为继手术、放疗、化疗之后第四类已被证明具有显著临床治疗效果及优势的治疗肿瘤的方法。而自然杀伤（natural killer，NK）细胞在机体中参与抗病毒、病原微生物和肿瘤的免疫，是机体先天性免疫的第一道天然防线［2］。基于其在体内通过非MHC限制性方式识别肿瘤细胞并对其进行杀伤；另外还通过分泌多种细胞因子及趋化因子，对其他免疫细胞的免疫调节功能进行调节。因此，近些年来NK细胞受到越来越多研究者的重视，并逐渐应用于临床肿瘤的治疗［3-4］。但由于NK细胞在外周血中仅占淋巴细胞总数的5%～10%，临床疗效受限于临床回输NK细胞的数量。为了建立人外周血NK细胞的有效扩增方法，获得足够数量的NK细胞以满足临床治疗的需要，体外提高NK增殖率和杀功能是十分重要的。因此，本研究用不同剂量的TWS119不同的体外诱导方式培养NK细胞后，观察其对NK细胞增殖和杀伤甲状腺癌BCPAP细胞活性的影响。

材料与方法

1 材料

NK细胞培养基CellGro® GMP SCGM购自德国Cell Gro公司；RPMI 1640培养基和小牛血清均购自美国Gibco公司；重组人白介素-2（rhIL-2）为北京四环生物制药有限公司产品；TWS119购自sigma公司；人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术研究所；荧光抗体PerCP-cy5.5-CD3、FITC-CD56、PE-Perforin和PE-Granzyme B和流式细胞仪均为美国Becton Dickson公司；人AB型血浆购自徐州市中心血站。

2 方法

2.1 NK细胞的培养 抽取健康人外周血20mL用肝素抗凝，将血缓慢加入淋巴细胞分离液中后，用1800r/min离心10min，用移液枪轻轻吸取单个核细胞层于装有生理盐水的离心瓶中1800r/min离心15min进行洗涤2次。将洗涤后的细胞加入装有NK培养基的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，再根据细胞生长情况及时添加NK培养基。

2.2 NK细胞鉴定 将在体外NK培养基中培养10d的NK细胞置于倒置显微镜下进行形态观察，并用PerCP-cy5.5-CD3和 FITC-CD56抗体标记NK细胞进行流式细胞仪进行表型检测。

2.3 TWS119对NK细胞和BCPAP细胞增殖的影响 取对数生长期甲状腺癌BCPAP细胞，用胰酶消化液消化后制成细胞悬液接种于96孔板，放入细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁。将NK细胞密度调整至1.0×105/mL，用移液器吸取180μL接种于96孔板中，每孔再加入不同浓度的TWS119（终浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L），每组设置4个复孔。于培养箱中培养72 h后，每孔加入20μL的CCK-8检测液，继续培养4 h后于450 nm处测定光密度值。

2.4 流式细胞仪检测NK细胞上颗粒酶和穿孔素的表达 将培养获得的NK细胞配成浓度为1.0× 105/mL的细胞悬液，接种于6孔培养板，每孔加3mL，然后加入TWS119（终浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L），每组做 3个重复孔。于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h。收集细胞并用PBS洗涤2次，每管加入PerCP-cy5.5-CD3和FITCCD56 NK细胞标记抗体20μL，避光孵育15min，加入固定液100μL室温避光孵育15min固定细胞后用PBS洗涤1次。每管再加100μL破膜液进行破膜，10μL的PE-Perforin和PE-Granzyme B抗体，室温避光孵育15min后用PBS洗涤后重悬于0.5 mL的PBS溶液中，分别用流式细胞仪检测NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达情况，结果采用FlowJo7.6.1软件进行分析。

2.5 TWS119作用NK细胞后对甲状腺癌BCPAP细胞杀伤活性 取对数生长期的BCPAP细胞接种于96孔板中作为靶细胞，接种密度为5× 103/孔，以TWS119处理72h后的NK细胞作为效应细胞，以10：1的效靶比加入，总体积为200μL/孔，同时设立空白对照组、靶细胞对照组和效应细胞对照组，每组做4个重复孔。培养24h后，每孔加入CCK-8液20μl再继续孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长处检测每孔的OD值，计算杀伤活性：

2.6 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行数据处理，数据以x±s表示，组间采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 NK细胞鉴定

将分离获得单个核细胞用NK细胞培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养，3天后NK细胞开始增殖，呈集落式生长，到10天后出现许多大小不同的细胞集落，细胞成椭圆形或梭形。用流式细胞仪检测NK细胞比率显示，在第1天加入TWS119进行诱导，CD3-CD56+的NK细胞比率随浓度增加逐渐降低，而在第7天加入 TWS119进行诱导时，NK细胞比率从（64.35±3.29）%升高到（67.35±2.75）%，但无统计学意义（图1）。

2 TWS119对NK细胞和BCPAP细胞增殖的影响

在第7天时加入不同浓度的TWS119（0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L）作用 NK细胞后，如图3所示各浓度组对其增殖率分别为：（100±2.49）%、（115.57±2.53）%、（131.87±3.19）%、（140.89± 3.12）%、（105.43±3.67）%、（86.38±3.58）%，与0μg/mL对照组相比，0-2.0μmol/L组增殖率显著高于对照组（*P＜0.05，**P＜0.01），其中TWS119浓度在2.0μmol/L时增殖率达到最高值，浓度超过2.0μmol/L时增殖率逐渐下降。而在第1天时加入TWS119作用NK细胞时，细胞增值率随TWS119浓度的增加逐渐降低（**P＜0.01）（表1和图2A）。

而TWS119对甲状腺癌BCPAP细胞增殖影响检测结果显示，经不同浓度的TWS119 BCPAP细胞72h后，随着TWS119浓度的增加，对BCPAP细胞增殖抑制作用越明显（P＜0.05，P＜0.01）（表1和图2B）。

3 TWS119对NK细胞中颗粒酶、穿孔素表达的影响

TWS119与NK细胞共同培养72h后，FCM检测结果如图3显示，随TWS119浓度增加，NK细胞穿孔素的阳性表达率逐渐升高，从对照组的（73.64±3.04）%升高到（93.02±2.17）%；而颗粒酶B的阳性表达率变化不明显（表2和图3）。

表2 TWS119诱导NK细胞72h后对颗粒酶B和穿孔素表达的影响

4 TWS119对NK细胞杀伤甲状腺癌BCPAP细胞活性的影响

γδT细胞经TWS119诱导72 h后的，在效靶比为10：1时对甲状腺癌BCPAP细胞的杀伤率分别为：（34.62±3.02）%、（40.37±3.81）%、（51.98± 3.09）%、（55.21±4.69）%和（58.81±2.32）%。与对照组（30.54±2.89）%相比，随着作用γδT细胞的TWS119浓度增加，γδT细胞杀伤BCPAP细胞活性增强（表3和图4）。其杀伤结果与穿孔素表达结果相一致，提示TWS119杀伤甲状腺癌BCPAP细胞的的机制可能是通过提高穿孔素的表达来实现的。

表3 TWS119处理48h后的NK细胞对甲状腺癌BCPAP细胞杀伤效应

讨 论

Wnt/β-catenin信号转导通路在胸腺细胞的生长发育和T淋巴细胞的迁移中起着重要的作用［5-6］。4，6-二取代吡咯并嘧啶（TWS119）是糖原合酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抑制剂，研究人员发现TWS119通过激活CD8+T淋巴细胞Wnt/β-catenin信号通路获得干细胞样记忆细胞（Stem cellsmemory T cells，TSCM）和早期分化T细胞，这群细胞在体内具有强增殖能力和抗肿瘤活性［7-9］。陈永强等［10］研究发现TWS119体外可以促进γδT细胞增殖和CD62L和CD45RA的表达。然而，TWS119对体外诱导培养的NK细胞的纯度、增殖及杀伤甲状腺癌BCPAP细胞活性的影响尚未见报道。本实验结果显示，在第1天加入TWS119进行诱导培养时，对NK细胞的增殖及纯度呈抑制作用，而在第7天加入TWS119进行诱导培养时，浓度在0.5～2μmol/L范围时能促进γδT细胞的增殖。提示TWS119对NK细胞的增殖有一定程度的促进作用，这可能对于体外培养获得足量的NK细胞用于肿瘤的免疫治疗提供了实验依据。

NK细胞是一群细胞表面标记为CD3-CD56+的淋巴细胞，在机体中通过MHC非限制性方式对肿瘤细胞进行识别，然后再通过释放穿孔素、颗粒酶B和Fas/FasL等方式进行杀伤。穿孔素是表达于T淋巴细胞、NK细胞细胞质中的细胞毒颗粒，当这些免疫细胞与肿瘤细胞接触后，释放出穿孔素并在肿瘤细胞膜上形成管状通道，使肿瘤细胞内外通透导致靶细胞溶解破坏［11］。而颗粒酶B则是T淋巴细胞和NK细胞中重要的丝氨酸蛋白酶，其通过 caspases依赖和非依赖途径杀伤靶细胞［12］。本研究流式检测结果显示，TWS119作用NK细胞后，穿孔素的阳性表达率较对照组明显升高，且具有一定的剂量依赖性，而颗粒酶的表达变化不明显；另外体外杀伤实验显示，经TWS119作用的NK细胞对甲状腺癌BCPAP细胞的杀伤显著升高，与穿孔素的检测结果相一致，提示TWS119杀伤甲状腺癌BCPAP细胞的的机制可能是通过提高穿孔素的表达来实现的。

本研究结论是TWS119在一定浓度范围内能促进NK细胞的增殖和增强对甲状腺癌BCPAP细胞的杀伤功能。我们研究结果为进一步提高NK细胞治疗甲状腺癌提供了实验依据。

［1］Kilfoy B A，Zheng T，Holford TR，et al.International patterns and trends in thyroid cancer incidence.Cancer Causes Control，2009，20（5）：525-531.

［2］Ramirez K，Kee B L.Transcriptional regulation of natural killer cell development.Curr Opin Immunol，2010，22（2）：193-198.

［3］Campbell K S，Hasegawa J.Natural killer cell biology：an update and future directions.JAllergy Clin Immunol，2013，132（3）：536-544.

［4］Cheng M，ChenY， XiaoW， etal.NKcell-based immunotherapyformalignant diseases.Cell Mol Immunol，2013，10（3）：230-252.

［5］Serio R N.Wntof the Two Horizons：Putting Stem Cell Self-Renewal and Cell Fate Determination into Context.Stem Cells Dev.2014；23（17）：1975-90.

［6］Kvell K，Fejes A V，Parnell SM，et al.Active Wnt/beta-catenin signaling is required for embryonic thymic epithelial development and functionality ex vivo.Immunobiology，2014，219（8）：644-652.

［7］Gattinoni L，Lugli E，Ji Y，et al.A human memory T cell subset with stemcell-like properties.Nat Med，2011，17（10）：1290-1297.

［8］Forget M A，Huon Y，Reuben A，et al.Stimulation of Wnt/βcatenin pathway in human CD8+T lymphocytes from blood and lung tumors leads to a shared young/memory phenotype.PLoSOne，2012，7（7）：e41074.

［9］Muralidharan S，Hanley P J，Liu E，et al.Activation of Wnt signaling arrests effector differentiation in human peripheral and cord blood-derived T lymphocytes.J Immunol，2011，187（10）：5221-5232.

［10］陈永强，郑璐，刘军权，等.糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119对γδT细胞增殖及表型的影响.中国免疫学杂志，2015，31（7）：66-70.

［11］Bi E，Huang C，Hu Y，et al.Functional assessment of perforin C2 domain mutations illustrates the critical role for calcium-dependent lipid binding in perforin cytotoxic function.Blood，2009，113（2）：338-346.

［12］Prakash M D，Bird C H，Bird P I.Active and zymogen foms of granzyme B are constutively released from cytotoxic lymphocytes in the absence of target cell engagement.Immunol Cell Biol，2009，87（3）：249-254.

（李 凌编辑）

Effects of TWS119 on Human NK Cells Grow th and K illing Function

WANG Hai，ZHENG Lu，TANG Xin-xing，CHEN Yong-qiang，ZHOU Zhong-hai，CHEN Fu-xing
（Department of Nuclear Medicine，the Affiliated People Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212002，China）

Objective To investigate the effects of 4，6-disubstituted pyrrolopyrim idine（TWS119），a glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β）inhibitor on human NK cells grow th and killing function.M ethods Using SCGM medium to cultivate human peripheral blood NK cells in vitro.Different concentrations of TWS119 were added in the culture at day one and day 7，proliferation rates and killing activities of NK cells in each group were determ ined by CCK-8 and flow cytometry.Results After 10 days of culture，TWS119 inhibited the grow th ratio of NK cells in day one group.In day 7 group，TWS119 could promote the grow th of NK cells when the concentration was increased from 0 to 2.0μmol/L and decreased thereafter.In addition，TWS119 at0.5-8.0μmol/L could increase the expression of perforin and enhance the cytotoxic activity of NK cells to BCPAP cells.Conclusion TWS119 could promote the proliferation of NK cells and enhance the cytotoxic activity of NK cells to BCPAP cells.

NK cells； TWS119； BCPAP cells； Perforin； Cells grow th

10.11748/bjm y.issn.1006-1703.2016.05.025

2016-02-15；

2016-03-28