王雪 李海全 肖香 李霞 黄宇 谭林/四川省北川羌族自治县农业局

北川白山羊两例肺炎支原体PCR检测及药敏实验

王雪 李海全 肖香 李霞 黄宇 谭林/四川省北川羌族自治县农业局

羊支原体性肺炎（Mycoplasma ovipneumoniae MO），在我国四川、甘肃等省区，从具有类似山羊传染性胸膜肺炎症状和病理变化的绵羊和山羊中分离到本病原并经过与国际标准菌株Y98对型，鉴定为绵羊肺炎支原体。本病常呈地方性流行，在北川县呈流行趋势，影响到养羊业正常生产与发展。

2016年6月，北川县某白山羊场未经申报审批私自从山东省某羊场引进1只波尔山羊种羊，引进10天后，该场山羊陆续出现咳嗽、消瘦、流浆液性鼻漏等症状，后陆续出现死亡，我中心技术人员到达现场后，病羊呼吸困难，眼险肿胀，剖检2头病羊，肺两侧对称性肉变，呈浅粉灰色，肺间质增生炎。胸腔有淡黄色积液，采集肺组织并做药敏试验，现报告如下：

一、材料与方法

1.样品采集。采集疑似感染肺炎支原体的山羊肺组织各1份，冷冻保存，低温运输。

2.主要培养基。15%马血清改良Hayfliek氏培养基，琼脂0.7%的血清琼脂培养基。

3.主要试剂。主要各药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

4.PCR检测。

（1）PCR引物设计与合成。参照已发表的羊肺炎支原体和丝状支原体保守序列设计引物并合成。

（2）肺组织中病原DNA的提取。采用Trizol法提取细菌总DNA。

（3）PCR扩增。采用25μl反应体系。

（4）电流观察结果。反应结束后，取5μlPCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，并在凝胶成像系统上观察、拍照。结果如图1。

5.药敏试验。

（1）培养特性。

（2）染色镜检。取所分离细菌纯化后进行药物敏实验。药物敏感性试验参照CLSI标准的药敏纸片法进行，选用β-内酰胺类，氨基糖苷类，喹诺酮类，大环内酯类，四环素类等33种药敏纸片。结果见表1。

二、结果与分析

1.支原体感染的诊断主要依靠病原学检测，支原体分离和培养是诊断的金标准，但是支原体分离培养是个复杂而漫长的过程。因为病料很容易受到其他支原体和杂菌的污染，两份样本中检测出均为羊肺炎支原体阳性，丝状支原体为阴性。

2.从药敏试验结果可见本文分离的菌株已经产生了很强的耐药性，该菌对利福平、SMZ+TMP、万古霉素替卡西林/克拉维酸等药物敏感，对喹诺酮类、氟苯尼考等常用治疗支原体药物不敏感。

图1　羊肺炎支原体和丝状支原体双重PCR电泳图

药物种类药物名称判断标准（单位：mm）敏感中敏耐药羊菌株1羊菌株1 β-内酰酶抑制剂阿莫西林/克拉维酸＞=1814-17＜=13中介（16）耐药（12）氨苄西林/舒巴坦＞=1512-14＜=11敏感（17）敏感（20）替卡西林/克拉维酸＞=2015-19＜=14敏感（28）敏感（20）头孢噻吩（先锋Ⅰ）＞=1815-17＜=14耐药（11）中介（15）头孢拉定（先锋Ⅵ）＞=1815-17＜=14耐药（无）中介（16）头孢吡肟＞=1815-17＜=14敏感（19）敏感（22）头孢噻肟＞=1815-17＜=14耐药（13）敏感（30）碳青霉烯类亚胺培南＞=1614-15＜=13敏感（21）敏感（19）头孢类壁霉素（替考拉宁）＞=1411-13＜=10敏感（18）敏感（21）万古霉素＞=1715-16＜=14敏感（22）敏感（28）杆菌肽＞=139-12＜=8耐药（无）耐药（无）氨基糖苷类丁胺卡那＞=1715-16＜=14敏感（20）敏感（25）磺胺类磺胺＞=1713-16＜=12耐药（无）中介（15）SMZ+TMP＞=2414-23＜=13敏感（31）敏感（29）截短侧耳类氟苯尼考＞=1813-17＜=12耐药（11）中介（14）利福霉素类利福平＞=2017-19＜=16敏感（31）敏感（32）糖肽类

3.对于本病的预防，主要的还是加强饲养管理，定期对圈舍彻底消毒，不能从疫区引进羊只，防止引入或迁出病羊带菌者，新引进羊必须隔离检疫1个月以上，确认健康时方可混入大群。流行地区可以全群注射山羊传染性胸膜肺炎氢氧化铝疫苗， 6月龄以上每羊5 ml，6月龄以下每羊3 ml，肌肉注射，1年1次。发病羊群应进行封锁，对病羊、可疑病羊和假定健康羊分群隔离和治疗对被污染的羊舍、场地、饲管用具和病羊的尸体、粪便等应进行彻底消毒或无害处理。

（略）

图2　：肺间质增生炎

图3　：肺两侧对称性肉变

图4　： 病羊流浆液性鼻漏

图5　：胸腔有淡黄色积液