李　婷, 曹　忠, 李盼盼, 何婧琳, 肖　慧, 杨　婵

(长沙理工大学化学与生物工程学院, 电力与交通材料保护湖南省重点实验室,微纳生物传感与食品安全检测协同创新中心, 长沙 410114)



聚胸腺嘧啶单链DNA-CuNCs荧光增强法用于汞离子的高灵敏检测

李婷, 曹忠, 李盼盼, 何婧琳, 肖慧, 杨婵

(长沙理工大学化学与生物工程学院, 电力与交通材料保护湖南省重点实验室,微纳生物传感与食品安全检测协同创新中心, 长沙 410114)

基于Hg2+与DNA中胸腺嘧啶(T)结合的高度特异性和DNA铜纳米簇的荧光增强性质, 构建了一种简便、 灵敏检测汞离子的新方法. 当Hg2+存在时, 聚T单链DNA(P1) 通过T-Hg2+-T 特异性结合形成双链DNA, Cu2+经抗坏血酸钠还原后生成的中间体Cu+与双链DNA螺旋结构间的氢键部分有强的结合力, 促使Cu0附着聚集在双链DNA上形成铜纳米簇, 导致体系荧光增强, 从而实现对汞离子的高灵敏检测. 体系荧光强度与Hg2+浓度的对数值成正比, 对Hg2+检测的线性范围为1.0 nmol/L～10 μmol/L, 检出限达0.4 nmol/L, 对湖水样品中Hg2+检测的回收率达到97.2%～106.6%. 与传统方法相比, 该方法具有无需标记、 检出限低及选择性好等优点, 可用于环境水体中汞离子的测定.

荧光增强; 环境水样; 铜纳米簇; T-Hg2+-T; 汞离子

汞离子是环境中危害最大的重金属污染物之一, 具有致癌、 致畸作用, 是一种蓄积性毒物, 容易侵蚀人的肾脏、 肠胃和神经系统, 严重危害人体健康[1]. 因此, 寻求快速、 准确检测汞离子的方法对于食品安全、 环境污染及临床医学等领域具有重要意义. 目前, 检测汞离子的方法有比色法[2]、 电化学法[3]、 表面增强拉曼光谱法[4]和表面等离子体共振法[5]等. 这些方法大都存在操作复杂、 分析成本高等缺点, 使其应用受到限制. 荧光分析法具有响应时间短、 灵敏度高、 选择性好、 用样量少及操作简便等优点, 近年来备受青睐[6]. 目前, 检测汞离子的荧光探针主要有以下5种类型:(1) 有机染料, 如王恩举等[7]基于罗丹明B与1,8-萘酰亚胺间的荧光共振能量转移, 构建了一种高选择性Hg2+比率荧光探针, 加入汞离子可诱导探针分子在540 nm处的发射带逐渐消失, 同时在580 nm附近产生强荧光, 溶液颜色由浅绿色变成橙色, 实现了对汞离子的比色和比率荧光双重响应. 该方法虽然荧光量子产率高且荧光染料易得, 但其荧光发射光谱宽、 稳定性差且易被漂白. (2) 共轭聚合物, 如Liu等[8]以聚[3-(3′-N,N,N-二甲基氨基-1′-Pro-丙氧基)-4-甲基-2,5-噻吩盐酸盐](PMNT)和汞特异型富胸腺嘧啶寡核苷酸(MSO)为检测器, MSO易与Hg2+形成T-Hg2+-T茎环结构, 利用PMNT与Hg2+和Hg2+-MSO不同的连接方式诱发体系构象变化, 从而展现出荧光性能上的差异, 实现了对汞离子的灵敏检测. (3) 量子点, 如Freeman等[9]用双(磺基)辛二酸为双官能团耦合富胸腺嘧啶核酸修饰CdTe/ZnS量子点, 当存在汞离子时, 量子点末端核酸形成T-Hg2+-T结构诱发体系荧光猝灭, 此荧光探针的汞离子检出限为10 nmol/L. 该方法的量子点合成过程较复杂, 且生物相容性不佳. (4) 纳米粒子, 如Huang等[10]报道了一种基于汞离子聚集诱导猝灭11-巯基十一酸修饰的金纳米粒子荧光传感器, 并通过改变金纳米粒子表面的硫醇配体种类来调控体系荧光性能, 汞离子的检出限为5 nmol/L. 此法虽然实现对汞离子的灵敏检测, 但纳米粒子表面需修饰, 操作较繁琐. (5) 金属纳米簇, 这是近年来发展的新型荧光纳米材料, 因其制备简单、 光学性质优良且生物相容性好, 已成为研究热点[11～13]. 如Wang等[14]合成了以富胸腺嘧啶DNA链S1为模板形成的银纳米簇(AgNCs), 利用碳纳米管的高荧光猝灭能力将体系荧光猝灭, 而汞离子能与S1链中的胸腺嘧啶结合形成稳定的T-Hg2+-T结构, 使银纳米簇从碳纳米管上脱离, 导致体系荧光恢复, 并利用核酸外切酶Ⅲ的辅助循环放大原理, 实现了汞离子的超灵敏检测. 该方法检出限虽然低至30 pmol/L, 但其操作步骤繁琐, 制备条件苛刻.

相对于银纳米簇等贵金属纳米簇, 作为普通金属的铜纳米簇(CuNCs)的报道较少, Cu具有与Au和Ag相似的性能, 但价格比Au和Ag便宜, 合成CuNCs的前体更容易得到, 且铜纳米簇制备条件温和, 操作简单、 快速. 目前, 制备铜纳米簇的方法有模板法[15]、 刻蚀法[16]及微波法[17]等. 常用的模板分子有寡聚核苷酸(DNA)、 多肽和蛋白质、 硫醇类化合物及树枝状聚合物等. Mokhir等[18]合成了以双链DNA为模板的强荧光铜纳米簇, 并发现通过改变双链DNA模板的长度可调控铜纳米簇的尺寸和荧光性质, 其后以DNA为模板的铜纳米簇的合成与应用受到关注, 如利用以双链DNA为模板合成的铜纳米簇实现了对单碱基错配[19]、 核酸酶[20]、 三磷酸腺苷[21]、 铅离子[22]和多巴胺[23]等的灵敏检测. 此外, Qing等[24]发现聚T单链DNA同样也可以作为合成铜纳米簇的模板, 合成过程仅需5 min; 基于此, 他们[25]将聚T单链DNA封锁在带状水凝胶中, 从水凝胶微孔注入铜离子, 构建了一种便捷、 经济及可视化检测铜离子的新方法. Ou等[26]利用Pb2+易与Cu+发生嗜金属作用, 破坏聚T铜纳米簇结构从而使该传感体系荧光强度减弱, 实现了对Pb2+的灵敏检测, 检出限为0.4 nmol/L. 因聚T单链DNA铜纳米簇合成简单快速, 故在此基础上开发新的荧光传感新方法将具有广阔的发展前景.

本文利用汞离子介导, 以聚T单链DNA为模板合成铜纳米簇, 形成稳定的T-Hg2+-T结构, 诱导单链DNA-CuNCs转变成双链DNA-CuNCs, DNA构象的变化引起体系荧光增强, 从而建立一种简单、 高灵敏检测汞离子的荧光增强传感新方法.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

DNA核酸探针序列P1(5′-CGGCTTACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCTTCTTTCTA-ATA-3′)购于大连宝生物工程技术服务有限公司; 3-吗啡丙磺酸(MOPS)和抗坏血酸钠(C6H7NaO6)购于德国Sigma-Aldrich公司; 五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)、 硝酸汞[Hg(NO3)2]和氯化钠购于上海国药集团化学试剂有限公司; 所用试剂除特别说明外均为分析纯; MOPS缓冲溶液(10 mmol/L MOPS+150 mmol/L NaCl, pH=7.6)用于制备铜纳米簇. 实验用水为过滤除菌后的超纯水(电阻率≥18.3 MΩ·cm); 配制生物试剂所用水和缓冲溶液均经高温、 高压灭菌.

F-7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司); PHSJ-3F型pH计(上海雷磁仪器厂); CZ-500L-W型超纯水制备仪(北京国之源有限公司); 手提式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰医疗器械有限公司); BS124S电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司).

1.2DNA单链铜纳米簇的制备

参照文献[24]方法, 以聚T为模板, 将P1核酸链溶解在3-吗啡丙磺酸MOPS缓冲溶液中配制成P1母液. 将2.0 mmol/L抗坏血酸钠加入500 nmol/L P1核酸链中, 充分混合后, 再加入1.0 mmol/L 硫酸铜, 用移液枪头轻轻搅拌后, 将溶液置于黑暗环境下于室温培育5 min, 测定其荧光光谱.

1.3DNA双链铜纳米簇的制备

将500 nmol/L P1核酸链溶液与10 μmol/L 硝酸汞溶液充分混合均匀后, 于室温反应30 min, 再依次加入2.0 mmol/L 抗坏血酸钠和1.0 mmol/L 硫酸铜, 用移液枪头轻轻搅拌混合均匀后, 置于黑暗环境下于室温培育5 min, 测定其荧光光谱.

2　结果与讨论

2.1检测原理的探讨

Hg2+的检测原理如图1所示, 采用抗坏血酸钠为还原剂, 将Cu2+还原成Cu0, 还原过程中伴随着中间体Cu+的生成. Cu+与胸腺嘧啶T中的氧原子有微弱的结合[27]; 同时, Cu+自歧化反应生成的Cu0聚集在富含T的单链DNA上形成铜纳米簇, 产生微弱的荧光信号, 其发射峰位于590 nm. 当存在Hg2+时, Hg2+与DNA中的胸腺嘧啶T高度特异性结合形成稳定的T-Hg2+-T配合物[28], 诱导单链DNA折叠成双链DNA, DNA有效的配对和堆叠对铜纳米簇的形成有潜在的影响, 此双链DNA中的非Waston-Crick氢键部分被认为是Cu+的强结合位点[27], 致使经Cu+歧化后的Cu0更容易聚集在双链DNA螺旋结构内, 从而产生增强的荧光信号, 且发射峰位置由590 nm漂移到610 nm处, 表明形成了不同于原有体系尺寸的铜纳米簇, 即由单链荧光铜纳米簇转变成双链荧光铜纳米簇的成分增多, 从而实现对Hg2+的灵敏检测. 因此, 双链DNA比单链DNA更容易形成铜纳米簇, 致使体系荧光增强, 基于此构建了非标记灵敏检测汞离子的荧光分析新方法.

Fig.1　Schematic illustration of the Hg2+ sensing strategy based on the fluorescence enhancing of copper nanoclusters

2.2汞离子介导铜纳米簇荧光增强

Fig.2　Fluorescence emission spectra of different systems The final concentrations of P1, sodium ascorbate, Hg2+ and Cu2+ were 500 nmol/L, 2.0 mmol/L, 100 nmol/L, and 1.0 mmol/L, respectively. a. P1; b. P1+sodium ascorbate; c. P1+Hg2+; d. P1+sodium ascorbate+Hg2+; e. P1+Cu2++sodium ascorbate; f. P1+ Cu2++sodium ascorbate+Hg2+.

为了考察实验中各组分对DNA-CuNCs体系荧光强度的影响, 尤其是汞离子对铜纳米簇荧光强度的影响, 对6种不同体系进行了荧光检测. 如图2所示, 核酸探针P1、 硝酸汞和抗坏血酸钠3种物质均无荧光发光基团; 将P1、 硝酸汞和抗坏血酸钠两两组合或者全部组合无法改变各物质本身的分子结构和发光特性, 也不能生成具有荧光性质的新物质, 因此谱线a～d均无荧光信号; 当P1、 硫酸铜和抗坏血酸钠同时存在时, 形成的铜纳米簇在590 nm处有荧光信号产生(谱线e). 而当体系中存在100 nmol/L Hg2+时, 体系荧光强度由原来的311.3升高到434.1, 发射峰位置由590 nm漂移到610 nm(谱线f). 此结果表明, 汞离子的介入不仅增强了体系的荧光强度, 而且合成了不同于原有体系尺寸的铜纳米簇, 其原因是Hg2+与DNA中的胸腺嘧啶T可高度特异性结合形成稳定的T-Hg2+-T配合物, 诱导单链DNA折叠成双链DNA, 由于Cu+与双链DNA螺旋结构间的氢键部分有强的作用力, 使得Cu+的歧化产物Cu0更容易聚集在双链DNA, 导致体系荧光强度增强, 因合成铜纳米簇的模板分子P1构象的变化和Cu+在P1不同构象中的结合位点不同, 使得形成的铜纳米簇尺寸也不同. 以上结果表明, 基于聚胸腺嘧啶单链铜纳米簇荧光增强检测汞离子的方法设计合理, 可以对汞离子进行检测.

2.3孵育时间对体系荧光的影响

实验中, 将500 nmol/L P1与100 nmol/L 硝酸汞溶液混合均匀, 分别孵育10, 20, 30, 40和50 min后, 再依次加入2.0 mmol/L抗坏血酸钠和1.0 mmol/L硫酸铜, 置于黑暗环境下于室温培育5 min, 测定体系的荧光变化, 以考察汞离子对聚胸腺嘧啶DNA P1溶液孵育不同时间对体系荧光的影响. 结果表明, 在用汞离子孵育30 min后, 体系荧光增加幅度趋于平缓, 但在孵育时间30 min处荧光强度增幅最大(见图3), 因此实验选取汞离子孵育时间为30 min.

Fig.3　Effect of incubation time on the fluorescence intensity of DNA-CuNCs in the presence of 100 nmol/L Hg2+

Fig.4　Fluorescence spectra of DNA-CuNCs with addition of different concentrations of Hg2+ ions c(Hg2+)/(nmol·L-1):a. 0, b. 1.0, c. 10, d. 100, e. 103, f. 104.

2.4汞离子的检测

为进一步验证该传感器用于定量检测Hg2+的可行性, 将不同浓度的Hg2+同核酸链P1孵育形成T-Hg2+-T双链DNA结构. 图4示出了0～10 μmol/L范围内不同浓度汞离子所产生的荧光光谱图, 可见, 铜纳米簇的荧光强度随着汞离子浓度的增加而逐渐增强, 表明由汞离子介导单链DNA转变成的双链DNA逐渐增多, Cu+与双链DNA结合形成强荧光铜纳米簇. 在汞离子溶液浓度为1.0 nmol/L～10 μmol/L范围内, Hg2+浓度对数与铜纳米簇的荧光强度值呈现良好的线性关系, 其回归方程可拟合为F=47.87lgc+770.7, 根据空白响应的3倍标准偏差原则, 计算出其检出限为0.4 nmol/L, 比已有文献[7～10]报道的荧光生物传感器的检出限低.

2.5选择性考察

为验证该传感器对Hg2+的特异性识别能力, 考察了其它可能产生干扰的金属离子的影响. 图5为5 μmol/L Hg2+和50 μmol/L其它金属离子(Ni2+, Zn2+, Mg2+, Co2+, Ce2+, Ca2+, Fe3+, Fe2+, Cd2+, Ba2+, Al3+, Mn2+, Ag+和Cr2+)的相对荧光强度柱状图. 由图5可见, 只有Hg2+能引起铜纳米簇荧光强度的显著变化, 相当于Hg2+浓度10倍的其它金属离子的加入对铜纳米簇的荧光强度并无明显影响, 即不会干扰该传感器对Hg2+的检测, 这表明该传感器能在复杂的体系中检测低浓度的Hg2+.

Fig.5　Selectivity of DNA-CuNCs in the presence of 5 μmol/L Hg2+ ions and 50 μmol/L other metal ions a. Hg2+; b. blank; c. Ni2+; d. Zn2+; e. Mg2+; f. Co2+; g. Ce2+; h. Ca2+; i. Fe3+; j. Fe2+; k. Cd2+; l. Ba2+; m. Al3+; n. Mn2+; o. Ag+; p. Cr3+.

2.6湖水样品中汞离子的检测

为验证该传感器对实际水样中汞离子检测的可行性, 采集云影湖水(长沙)进行了分析研究. 所取湖水经过滤膜过滤, 去除浮游生物等杂质, 加入高压灭菌水将湖水样品稀释10倍, 采用标准加入法测定, 即在实际样品中加入已知标准浓度的汞离子, 测出其加入不同浓度Hg2+溶液前后荧光强度的变化值, 对照工作曲线计算出加标试样浓度值, 比较测量值与实际加入量, 所得回收率为97.2%～106.6%(见表1), 说明该传感器适用于实际水样中汞离子的检测, 在环境监测领域具有潜在的应用价值.

Table 1　Determination results of Hg2+ in Yunying lake water samples

3　结　　论

基于T-Hg2+-T结构诱导聚T单链DNA(P1)转变成双链DNA, 使Cu0更易附着聚集在双链DNA上形成强荧光铜纳米簇, 建立了一种高灵敏检测汞离子的荧光增强新方法. 与传统方法相比, 该方法简单、 无需标记, 灵敏度高(检出限达到0.4 nmol/L)且选择性好, 可用于环境水体中汞离子的检测. 此外, 铜纳米簇荧光增强探针报道较少, 其荧光增强机理有待进一步深入研究.

[1]Nolan E. M., Lippard S. J.,Chem.Rev., 2008, 108(9), 3443—3480

[2]Hao Y. L., Guo Q. Q., Wu H. Y., Guo L. Q., Zhong L. S., Wang J., Lin T. R., Fu F. F., Chen G. N.,Biosens.Bioelectron., 2014, 52, 261—264

[3]Wang D., Liu X. M., Fang Z. X., Li J., Sun M. J.,Chem.Res.ChineseUniversities, 2015, 31(4), 581—584

[4]Tang W. Q., Chase D. B., Sparks D. L., Rabolt J. F.,Appl.Spectros., 2015, 69(7), 843—849

[5]Wang L., Li T., Du Y., Chen C. G., Li B. L., Zhou M., Dong S. J.,Biosens.Bioelectron., 2010, 25(12), 2622—2626

[6]Das N. K., Ghosh S., Priya A., Datta S., Mukherjee S.,J.Phys.Chem.C, 2015, 119(43), 24657—24664

[7]Chen J. Y., Su W., Wang E. J.,Chem.J.ChineseUniversities, 2016, 37(2), 232—238(陈家逸, 苏伟, 王恩举. 高等学校化学学报, 2016, 37(2), 232—238)

[8]Liu X. F., Tang Y. L., Wang L. H., Zhang J., Song S. P., Fan C. H., Wang S.,Adv.Mater., 2007, 19(11), 1471—1474

[9]Freeman R., Finder T., Willner I.,Angew.Chem.Int.Ed., 2009, 48(42), 7818—7821

[10]Huang C. C., Yang Z., Lee K. H., Chang H. T.,Angew.Chem., 2007, 119(36), 6948—6952

[11]Tao Y., Li M. Q., Ren J. S., Qu X. G.,Chem.Soc.Rev., 2015, 44(24), 8636—8663

[12]Zhang L. B., Wang E. K.,NanoToday, 2014, 9(1), 132—157

[13]Guo Y. M., Cao F. P., Lei X. L., Mang L. H., Cheng S. J., Song J. T.,Nanoscale, 2016, 8(48), 4852—4863

[14]Wang G. F., Xu G., Zhu Y. H., Zhang X. J.,Chem.Commun., 2014, 50(6), 747—750

[15]Gao F. P., Cai P. J., Yang W. J., Xue J. Q., Gao L., Liu R., Wang Y. L., Zhao Y. W., He X., Zhao L., Huang G. D., Wu F. S., Zhao Y. L., Chai Z. F., Gao X. Y.,ACSNano, 2015, 9(5), 4976—4986

[16]Zhong Y. P., Wang Q. P., He Y., Ge Y. L., Song G. W.,Sens.ActuatorsB, 2015, 209, 147—153

[17]Bhamore J. R., Jha S. J., Munngara A. K., Singhal R. K., Sonkeshariya D., Kailasa S. K.,Biosens.Bioelectron., 2016, 80, 243—248

[18]Rotaru A., Dutta S., Jentzsch E., Gothelf K., Mokhir A.,Angew.Chem.Int.Ed., 2010, 49(33), 5665—5667

[19]Jia X. F., Li J., Han L., Ren J. T., Yang X., Wang E. K.,ACSNano, 2012, 6(4), 3311—3317

[20]Hu R., Liu Y. R., Kong R. M., Donovan M. J., Zhang X. B., Tan W. H., Shen G. L., Yu R. Q.,Biosens.Bioelectron., 2013, 42, 31—35

[21]Zhou Z. X., Du Y., Dong S. J.,Anal.Chem., 2011, 83(13), 5122—5127

[22]Chen J. H., Liu J., Fang Z. Y., Zeng L. W.,Chem.Commun., 2012, 48(7), 1057—1059

[23]Wang H. B., Zhang H. D., Chen Y., Huang K. J., Liu Y. M.,Sens.ActuatorsB, 2015, 220, 146—153

[24]Qing Z. H., He X. X., He D. G., Wang K. M., Xu F. Z., Qing T. P., Yang X.,Angew.Chem.Int.Ed., 2013, 52(37), 9719—9722

[25]Qing Z. H., Mao Z. G., Qing T. P., He X. X., Zou Z., He D. G., Shi H., Huang J., Liu J. B., Wang K. M.,Anal.Chem., 2014, 86(22), 11263—11268

[26]Ou L. J., Li X. Y., Liu H. W., Li L. J., Chu X.,Anal.Sci., 2014, 30(7), 723—727

[27]Russo N., Toscano M., Grand A.,J.MassSpectrom., 2003, 38, 265—270

[28]Berti L., Burley G. A.,NatureNanotech., 2008, 3, 81—87

(Ed.:N, K)

† Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.31527803, 21275022, 21545010).

High-sensitive Fluorescent Enhancement Detection of Hg(Ⅱ) Ions Based on Poly(thymine)-templated Copper Nanoclusters†

LI Ting, CAO Zhong*, LI Panpan, HE Jinglin*, XIAO Hui, YANG Chan

(Collaborative Innovation Center of Micro/nano Bio-sensing and Food Safety Inspection,HunanProvincialKeyLaboratoryofMaterialsProtectionforElectricPowerandTransportation,SchoolofChemistryandBiologicalEngineering,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha410114,China)

A rapid sensitive fluorescent sensor was developed for Hg(Ⅱ) ions detection based on the specific thymine-Hg2+-thymine structure and photoluminescent property of DNA copper nanoclusters. Upon the addition of Hg2+, poly thymine single strand DNA(P1) is transformed into double strand DNA through the formation of T-Hg2+-T configuration. Sodium ascorbate is effective to reduce Cu2+to Cu0, and this reduction process is accompanied by formation of intermediate Cu+. However, Cu+has a strong binding site within hydrogen-bonding moieties in the helix of dsDNA which facilating Cu0gathered in dsDNA to form stronger fluorescent copper nanoclusters than ssDNA copper nanoclusters, and these changes in fluorescence intensity of DNA-CuNCs are allowed for sensitive analysis of Hg(Ⅱ) ions. Satisfactory linear relationship and detection limit were obtained. The resulting calibration plots exhibited good linear correlations in the range from 1.0 nmol/L to 10 μmol/L for Hg(Ⅱ) ions, and the detection limits of Hg(Ⅱ) ions was 0.4 nmol/L. The proposed method was highly selective and other metal ions have no interfering effects on the determination. Moreover, satisfactory results were obtained while the proposed method was applied to determination of Hg2+in real lake samples.

Fluorescence enhancement;Environmental water sample; Copper nanoclusters; T-Hg2+-T; Mercury ion

10.7503/cjcu20160319

2016-05-09. 网络出版日期:2016-08-17.

国家自然科学基金(批准号:31527803, 21275022, 21545010)资助.

O657.3

A

联系人简介:曹忠, 男, 博士, 教授, 主要从事纳米生物传感与食品安全检测方面的研究. E-mail:zhongcao2004@163.com

何婧琳, 女, 博士, 讲师, 主要从事纳米生物传感与核酸适配体分析方面的研究. E-mail:jinglin_he@163.com