李雪平，庞 正，周振威，王 涛

（天津大学生命科学学院，天津 300072）

西西里病毒抑制Ⅰ型干扰素的产生机制

李雪平，庞 正，周振威，王 涛

（天津大学生命科学学院，天津 300072）

西西里病毒属布尼亚病毒科白蛉病毒属.在病毒感染机体过程中，病毒非结构蛋白可特异性靶向细胞内相关因子，阻断或抑制宿主天然免疫信号通路的激活.利用双报告基因检测系统，发现西西里病毒非结构蛋白可抑制Ⅰ型干扰素的产生，通过免疫共沉淀分析，证实该现象不依赖于 TBK1，并首次发现了西西里病毒非结构蛋白通过蛋白酶体依赖的途径降解宿主相关因子，进而抑制Ⅰ型干扰素表达这一机制.这一结果为更好地了解西西里病毒致病机理及相关治疗药物的研发提供了理论支持.

西西里病毒；非结构蛋白；Ⅰ型干扰素；降解

西西里病毒（Sandfly fever Sicilian virus，SFSV）为包膜、分节段、负链RNA病毒，属布尼亚病毒科白蛉病毒属.该病毒主要流行区域为地中海、中东、北非和中南亚地区，病毒感染可引起的临床症状从短暂的、自限性发热，表现为快速发作高烧，严重肌痛和关节痛、头痛等，在某些情况下，部分患者出现畏光、腹部不适及恶心等情况.

干扰素（Interferon，IFN）介导的天然免疫反应是宿主抵抗病毒感染的重要防线，Ⅰ型 IFN主要包括IFN-α/β等，可由多种有核细胞分泌，是天然免疫重要的组成部分，可在病毒感染早期抑制病毒的复制［1-2］.病毒感染细胞后，释放核酸，被胞浆中特异的模式识别受体识别，经过相应配体的结合和下游信号转导，启动干扰素和其他细胞因子基因的转录.RIG-I是重要的病毒核酸模式识别受体之一，包含两个 caspase活化和募集结构域、一个RNA解旋酶/ATP酶结构域和一个调节结构域，RIG-I活化后可被线粒体衔接蛋白MAVS识别，依次激活干扰素转录因子，诱导干扰素表达［3］.

病毒进化出多种不同的机制来逃避天然免疫，病毒蛋白可通过调控Ⅰ型 IFN信号通路来抑制其表达［4-7］.白蛉病毒非结构蛋白 NSs被认为是主要的Ⅰ型IFN拮抗剂；裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）NSs蛋白可干扰宿主基因的转录，从而限制宿主早期阶段的天然免疫反应；发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV）NSs蛋白能够形成包涵体，同时可结合并劫持TBK1进入包涵体中，使得这些细胞因子在胞内的分布情况改变；托斯卡纳病毒（Toscana virus，TOSV）NSs蛋白可诱导通路中细胞因子降解.同一病毒属的 SFSV NSs蛋白同样能够抑制宿主Ⅰ型干扰素的产生，但具体机制尚不明确［8］.

笔者通过表达SFSV NSs蛋白，利用IFN-β 启动子报告基因检测、免疫印迹（Western blot）及免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）等实验方法，以期发现 SFSV NSs蛋白抑制Ⅰ干扰素通路的作用机制，为该种病原体的防治和相关药物的研发提供理论指导.

1　材料与方法

1.1材 料

真核细胞表达载体 VR1012来自吉林大学，pIFN-β-luc、pNF-κB-luc、pISRE-luc、pRL-TK质粒和TBK1-V5表达质粒来自中国疾病预防与控制中心.分子克隆相关试剂：E.coli DH5α感受态、Fast pfu DNA聚合酶购自全式金公司；限制性内切酶SalⅠ和 BamHⅠ、T4，DNA连接酶均为 New England Biolabs公司产品；胰蛋白胨、酵母提取物购买于OXOID公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司.细胞培养相关试剂：FBS、PBS、青-链霉素、0.25%，胰酶、DMEM培养基购买于Gibco公司；Transfection Reagent为Roche公司产品；MG-132 proteasome inhibitor购自索莱宝公司. Co-IP及 Western blot检测相关试剂：蛋白酶抑制剂Cocktail、Anti-HA Affinity Matrix为 Roche公司产品；丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED购自 Bio-Rad公司；鼠抗 HA标签单克隆抗体、鼠抗 actin单克隆抗体、鼠抗 V5标签单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体、蛋白marker购自全式金公司；硝酸纤维素膜、HRP显色底物购自 Thermo公司.Dual-Luciferase 报告基因检测系统购自Promega公司.甘油、乙醇、甲醇、异丙醇、冰醋酸、盐酸、NaOH等常规化学试剂购自上海生工有限公司.

1.2方 法

细胞与病毒培养 HEK293T细胞购自ATCC，培养于含有10%，FBS和1%，青-链霉素的DMEM完全培养基中，置 37，℃、5%，CO2孵箱中培养.仙台病毒（Sendai virus，SEV）BB1株为中国疾病预防与控制中心惠赠，于 10日龄 SPF级鸡胚中培养，经火鸡红细胞血凝实验测定病毒血凝效价.

质粒构建、转染及蛋白检测：SFSV（GenBank accession NO.EF201822）NSs蛋白基因通过上海生工有限公司化学合成获得.根据相应基因序列设计引物，将SFSV NSs基因克隆入VR1012载体，并在3'端引入HA标签，以便于Co-IP及Western blot检测.实验所需引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成，引物序列为

上游

5'-ACGCGTCGACACCATGATGAACAGCCGA TACATGTTTG-3'.

下游

5'-CGGGATCCCTACGCGTAATCTGGGACGTC GTAAGGGTAAAAGTCAGAATCAGACGAGCTCT C-3'.

采用转染试剂参照说明书将一定量的质粒转染HEK293T细胞中，48，h后进行Western blot、Co-IP等检测.

双报告基因表达检测：使用罗氏转染试剂将0.5，μg SFSV NSs-HA（或SFTSV NSs-HA）表达质粒或对照载体与 0.5，μg pIFN-β-luc（或 pNF-κB-luc、pISRE-luc）质粒和 0.5，ng pRL-TK质粒共同转染 24孔板中的 HEK293T细胞，转染 24，h后，加入 SEV（20，HA/mL）刺激，病毒刺激 18，h后收集细胞，根据试剂盒说明书进行报告基因表达检测.

Western blot：转染后48，h收获细胞，加入适量含蛋白酶抑制剂 cocktail的 RIPA裂解液（50，mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150，mmol/L NaCl，1%， NP-40）冰浴裂解30，min，裂解液于4，℃、8.000g离心5，min，收集上清进行SDS-PAGE，之后将蛋白转膜至硝酸纤维膜上，经5%，牛奶封闭30，min，一抗4，℃孵育过夜，HRP标记二抗室温孵育 1，h后，用化学发光显色底物及Chemi Doc TMXRS+系统检测.

Co-IP：转染后 48，h收获细胞，用4，℃预冷的PBS洗涤2遍，加入 500，μL含蛋白酶抑制剂cocktail的 RIPA裂解液冰浴裂解 30，min，裂解液于 4，℃、8.000g离心10，min，收集上清，加入20，μL HA beads，于 4，℃低速旋转孵育 6，h，用适量 wash buffer（20，mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，100，mmol/L NaCl，0.05%，Tween20，0.1，mmol/L EDTA）温和洗涤6次，加入 50，μL 洗脱液（100，mmol/L Glycine-HCl，pH 2.5）洗脱，洗脱样本经 SDS-PAGE和 Western blot进行分析.

统计学分析：数据平均值和标准误差通过GraphPad Prism（5.01版本）分析处理得到.通过T检验计算P值，P值小于0.05时认为有统计学意义.

2　实验结果

2.1SFSV NSs蛋白抑制Ⅰ型IFN的产生

为了确定SFSV NSs蛋白是否为Ⅰ型IFN的拮抗剂，选取SFTSV NSs蛋白作为阳性对照，将表达两种不同病毒 NSs-HA的质粒连同 IFN-β启动子报告质粒 pIFN-β-luc和外参质粒 pRL-TK共同转染HEK293T细胞，经SEV刺激启动IFN-β的表达，通过双报告基因表达检测系统对 IFN-β启动子活性进行比较.SFSV与SFTSV NSs蛋白均明显抑制IFN-β启动子活性（见图1）.为了进一步确认该结果，将干扰素刺激应答元件（IFN-stimulated response element，ISRE）启动子报告质粒pISRE-luc替换pIFN-β-luc质粒，结果显示，SFSV与SFTSV NSs蛋白可明显抑制IFN的表达（见图2）.

图1　SFSV NSs蛋白抑制IFN-β启动子活性Fig.1 SFSV NSs protein suppressed the activity of IFN-β promoter

图2　SFSV NSs蛋白抑制ISRE启动子活性Fig.2　SFSV NSs protein suppressed the activity of ISRE promoter

IFN-β启动子的激活依赖于 NF-κB、IRF3和 c-Jun等转录因子结合到启动子调节区域来协同作用.为了确定哪些转录因子介导的信号通路被调控，这里检测了SFTSV和SFSV NSs蛋白对NF-κB信号通路的影响，将 NF-κB启动子报告质粒 pNF-κB-luc转染细胞后进行双报告基因表达检测.SFTSV NSs蛋白不影响 NF-κB信号通路，与之不同的是，SFSV NSs仍然能够抑制该通路（见图3）.

图3　SFSV NSs蛋白抑制NF-κB启动子活性Fig.3　SFSV NSs protein suppressed the activity of NF-κB promoter

2.2SFSV NSs蛋白不通过与 TBK1结合来抑制Ⅰ型IFN的产生

SFTSV NSs蛋白抑制宿主 IFN-β的应答机制为：病毒感染或转染的细胞中 NSs蛋白能够形成胞浆包涵体，同时能够与 TBK1/IKKε复合物结合，并将磷酸化的 IRF3（P-IRF3）劫持到包涵体中，阻断活化的 P-IRF3进入细胞核，进而抑制Ⅰ型 IFN的表达.为确认SFSV NSs蛋白抑制Ⅰ型IFN的产生是否与TBK1有关，将SFTSV-NSs-HA及SFSV-NSs-HA表达质粒及 TBK1-V5表达质粒共同转染HEK293T细胞.Co-IP及 Western blot检测结果显示，与SFTSV不同，SFSV NSs蛋白与TBK1之间无明显的相互作用，即SFSV NSs蛋白抑制Ⅰ型IFN的产生不依赖于TBK1（见图4）.同时，SFTSV和SFSV NSs蛋白均不影响外源蛋白TBK1的表达，表明两种病毒的NSs蛋白均不干扰宿主基因的转录.

图4　SFSV NSs蛋白和TBK1免疫共沉淀分析Fig.4 Co-immunoprecipitation assays on SFSV NSs protein and TBK1

2.3SFSV NSs蛋白通过蛋白酶体依赖的途径来抑制Ⅰ型IFN的产生

文献［9］指出与 SFSV同属于白蛉热病毒组的致病性病毒 TOSV，可通过降解内源因子来抑制干扰素产生.为了确认SFSV NSs蛋白抑制Ⅰ型IFN的产生中是否存在该机制，利用蛋白酶抑制剂观察药物作用前后Ⅰ型IFN产生的差异.SFSV NSs-HA表达质粒与pIFN-β-luc、pNF-κB-luc、pRL-TK报告质粒共同转染HEK293T细胞，转染后24，h加入SEV及蛋白酶抑制剂 MG132（2，mmol/L），通过双报告基因表达检测系统对 IFN-β启动子活性进行比较.结果显示，MG132作用后，SFSV NSs蛋白完全失去了对IFN-β和 NF-κB启动子活性的抑制作用（见图5），表明SFSV NSs抑制Ⅰ型IFN的产生是通过蛋白酶体依赖的途径.

图5　MG132对SFSV NSs蛋白活性的影响Fig.5 Effects of MG132 on the activity of SFSV NSs protein

3　讨　论

病毒感染细胞后释放核酸，宿主通过模式识别受体识别病毒核酸，经下游信号通路激活Ⅰ型 IFN启动子，从而促进其表达.利用人工构建的IFN启动子调控的荧光素酶表达元件，通过对荧光素酶水平进行检测，可对IFN启动子活性进行定量和比较［10-15］.病毒进化出各种逃逸宿主抗病毒天然免疫应答的机制［16］，白蛉病毒中，RVFV作为一种代表性病毒，其NSs蛋白在病毒侵染的早期合成，进入细胞核后，与SAP30蛋白相互作用，抑制 IFN-α/β基因的转录，同时，RVFV NSs蛋白可促进双链RNA依赖的蛋白激酶PKR和TFIIH p62亚基的降解，进而影响eIF2的磷酸化，抑制宿主基因转录［17-19］；SFTSV的发现及研究表明其 NSs蛋白与 RIG-I、TRIM25、TBK1、IRF3和STAT1/2等IFN调控因子相互作用并将这些因子劫持到其形成的胞浆包涵体当中，通过影响相关因子的细胞内定位，调控Ⅰ型IFN信号通路［11］；TOSV的最新研究表明其 NSs蛋白可通过蛋白酶体依赖的途径降解相关因子（PKR和 RIG-I）从而抑制Ⅰ型 IFN的产生；而目前关于同一病毒属的SFSV抑制IFN的机制尚不明确［8］.

研究中结合已有白蛉病毒NSs蛋白拮抗IFN产生的研究结果，通过 IFN启动子报告系统、Co-IP及Western blot检测，试图寻找SFSV NSs蛋白抑制Ⅰ型IFN的机制.研究结果表明，SFSV NSs蛋白能够同时抑制 IFN-β和 NF-κB启动子活性，且不依赖于TBK1的结合，另外其抑制机制是通过蛋白酶体依赖的途径实现的.SFSV NSs蛋白具体作用靶点细胞因子还有待进一步的筛选和确定，更为重要的是，与其他白蛉病毒不同，SFSV NSs蛋白可抑制 NF-κB通路，表明新的机制的存在，还有待深入的研究.

SFSV NSs蛋白依赖蛋白酶体途径抑制Ⅰ型IFN的产生，为了解该病毒抗天然免疫机制的研究、防治和相关药物的研发提供了理论基础.

4　结　语

研究中利用双报告基因检测技术、免疫共沉淀技术以及免疫印迹等实验方法，发现西西里病毒通过非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素通路，非结构蛋白通过降解细胞信号通路中的因子来抑制Ⅰ型干扰素的产生，并且该降解途径是通过泛素蛋白酶体途径依赖的.该机制的发现为这类病原体的防治和相关药物的研发提供理论指导.

［1］ García-Sastre A，Biron C A. Type 1 interferons and the virus-host relationship：A lesson in détente［J］. Science，2006，312（5775）：879-882.

［2］ Samuel C E. Antiviral actions of interferons［J］. Clin Microbiol Rev，2001，14（4）：778-809.

［3］ Yoneyama M，Onomoto K，Jogi M，et al. Viral RNA detection by RIG-l-like receptors［J］. Current Opinion Immunology，2015，32：48-53.

［4］ Haller O，Kochs G，Weber F，et al. The interferon response circuit：Induction and suppression by pathogenic viruses［J］. Virology，2006，344（2006）：119-130.

［5］ Mibayashi M，Martinez-Sobrido L，Loo Y M，et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus［J］. Journal of Virology，2007，81（2）：514 -524.

［6］ Opitz B，Rejaibi A，Dauber B，et al. IFN-beta induction by influenza A virus is mediated by RIG-I which is regulated by the viral NS1［J］. Protein Cell Microbio，2007，9（4）：930 -938.

［7］ van Knippenberg I，Calton-Smith C，Elliott R M，et al. The N-terminus of Bunyamwera orthobunyavirus NSs protein is essential for interferon antagonism［J］. J Gen Virol，2010，91（8）：2002-2006.

［8］ Mclnerney G M，Karlsson Hedestam G B. Direct cleavage，proteasomal degradation and sequestration：Three mechanisms of viral subversion of typeⅠinterferon responses［J］. Innate Immun，2009，1（6）：599-606.

［9］ Gori-Savellini G，Valentini M，Cusi M G，et al. Toscana virus NSs protein inhibits the induction of type I interferon by interacting with RIG-I［J］. Journal of Virology，2013，87（12）：6660-6667.

［10］ Spiropoulou C F，Albariño C G，Ksiazek T G，et al. Andes and Prospect Hill hantaviruses differ in early induction of interferon although both can downregulate interferon signaling［J］. Journal of Virology，2007，81（6）：2769-2776.

［11］ Ning Y J，Wang M，Deng M，et al. Viral suppression of innate immunity via spatial isolation of TBK1/IKKepsilon from mitochondrial antiviral platform［J］. Mol Cell Biol，2014，6（4）：324-337.

［12］ Taylor K E，Mossman K L. Advances in understanding viral evasion of type I interferon［J］. Immunology，2013，138（3）：190-197.

［13］ Shi X，van Mierlo J T，French A，et al. Visualizing the replication cycle of bunyamwera orthobunyavirus expressing fluorescent protein-tagged Gc glycoprotein［J］. Journal of Virology，2010，84（17）：8460-8469.

［14］ Thompson M R，Kaminski J J，Kurt-Jones E A，et al. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection ［J］. Viruses，2011，3（6）：920-940.

［15］ Stark G R，Kerr I M，Williams B R，et al. How cells respond to interferons［J］. Biochem，1998，67：227-264.

［16］ Weber F，Bridgen A，Fazakerley J K，et al. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs counteracts the induction of alpha/beta interferon［J］. Journal of Virology，2002，76（16）：7949-7955.

［17］ Billecocq A，Spiegel M，Vialat P，et al. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription［J］. Journal of Virology，2004，78（18）：9798-9806.

［18］ May N L，Dubaele S，Santis L P D，et al. TFIIH transcription factor，a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus［J］. Cell，2004，116（4）：541-550.

［19］ Blakqori G，Delhaye S，Habjan M，et al. La Crosse bunyavirus nonstructural protein NSs serves to suppress the typeⅠinterferon system of mammalian hosts［J］. Journal of Virology，2007，81（10）：4991- 4999.

（责任编辑：田 军）

Mechanism of SFSV Inhibiting Type Ⅰ Interferon Responses

Li Xueping，Pang Zheng，Zhou Zhenwei，Wang Tao
（School of Life Sciences，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Sandfly fever Sicilian virus（SFSV）is a member of the Phlebovirus of Bunyavirus family. After the virus infects humans， non-structural （NSs） proteins of virus can target specific cellular proteins to counteract or inhibit the host innate immune signal action. In this study， it is found through luciferase reporter assays that the NSs proteins of SFSV inhibit activation of IFN-β promoter. Through co-immunoprecipitation assay， it is proved that SFSV NSs protein inhibiting typeⅠinterferon is not dependent on TBK1. It is discovered for the first time that the SFSV NSs protein inhibits typeⅠinterferon via degradation of factors through the proteasome-dependent pathway. This research provides a better understanding of typeⅠIFN counteracting mechanisms and novel therapeutic approaches for serious pathogens.

Sandfly fever Sicilian virus；non-structural protein；typeⅠinterferon；degradate

R373.3

A

0493-2137（2016）08-0830-05

10.11784/tdxbz201601080

2016-01-25；

2016-03-14.

国家自然科学基金资助项目（31270201）；国家重点基础研究发展计划（973 计划）资助项目（2011CB504700）.

李雪平（1990— ），女，硕士研究生，13752715067@163.com.

王 涛，wangtaobio@tju.edu.cn.

网络出版时间：2016-04-01. 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1127.N.20160401.1422.002.html.