张　鹏　周　健　王耀丽　卢海滨　杨雪飞　马凌云



·论著·

外周血Th17细胞对呼吸机相关性肺炎的早期诊断价值

张鹏周健王耀丽卢海滨杨雪飞马凌云

目的探讨外周血Th17细胞水平对呼吸机相关性肺炎(VAP)的早期诊断价值。方法收集本院2011年04月至2015年04月510例机械通气时间超过48 h患者的临床资料，根据是否发生VAP将其分为VAP组(95例)与非VAP组(415例)。采用流式细胞仪检测二组患者的外周血Th17细胞水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞因子白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-6(IL-6)水平，并同时记录临床肺部感染评分(CPIS)情况，分别比较二组患者外周血Th17细胞及IL-17、IL-6水平的差异以及Th17细胞水平与CPIS评分的相关性，评价外周血Th17细胞水平对VAP患者的早期诊断价值。结果VAP组患者外周血Th17细胞及IL-17、IL-6水平明显高于非VAP组患者(P<0.05)；经过抗感染治疗后，VAP组患者外周血Th17细胞、IL-17、IL-6水平及CPIS评分均较治疗前显著降低(P<0.05)。相关性分析显示，外周血Th17细胞水平与CPIS评分呈显著正相关(r=0.69，P<0.01)。ROC曲线分析显示，以外周血Th17细胞比例>7.4 %为早期诊断VAP界限时，诊断VAP的敏感性和特异性分别为83.6%和89.1%，ROC曲线下面积(AUC)为0.885(95%CI0.794～0.918)。结论VAP患者早期外周血Th17细胞水平显著升高，并且与CPIS评分具有较好的相关性，检测外周血Th17细胞水平可作为早期诊断VAP的有效指标。

呼吸机相关性肺炎；辅助Th17细胞；白细胞介素-17；诊断，早期

呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia, VAP)是指患者经机械通气大于48 h所形成的肺部感染，其发病率高，预后差，严重威胁患者身体健康，同时显著延长危重患者住院时间、增加其住院费用，给患者及社会带来沉重的经济负担[1-2]。因此，如何对VAP患者进行早期诊断，进而针对VAP患者进行个体化治疗，对改善患者预后具有重要的临床意义。辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)是近些年发现的一类新的淋巴细胞亚群，在多种免疫及感染性疾病中起着重要的作用，同时对于感染性疾病的早期诊断也具有较高的敏感性和特异性[3-5]。Th17细胞是否能对VAP进行早期诊断，目前相关研究尚未阐明。因此，本研究通过检测VAP患者外周血Th17及白细胞介素-17(interleukin-17, IL-17)水平，并分析Th17细胞与肺部感染评分(clinical pulmonary infection score, CPIS)的相关性，以期探讨Th17细胞在早期诊断VAP中的临床价值。

资料与方法

一、临床资料

选取2011年4月至2015年4月，在本院重症医学科行机械通气>48 h的510例患者作为研究对象，其中男295例，女215例，平均年龄(56.8±12.4)岁。根据是否发生VAP将其分为VAP组(95例)与非VAP组(415例)。VAP的诊断标准参照中华医学会2013年制定的《呼吸机相关性肺炎诊断、预防及治疗指南》[6]：①使用呼吸机辅助通气时间≥48 h或脱机≤48 h；②胸部X线检查可见肺部出现新的或进展性浸润阴影；③发热：体温升高(>38 ℃)，同时呼吸道出现大量脓性分泌物；④外周血白细胞>10.0×109/L或<4.0×109/L；⑤呼吸道分泌物经培养出现新的病原菌。排除标准：①机械通气时间≤24 h的患者；②机械通气以前已经确诊为肺炎的患者；③机械通气不能耐受，终止治疗的患者；④有严重免疫抑制的患者。两组间在年龄、性别、基础疾病及机械通气时间等方面，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得了医院伦理委员会的批准，并得到了患者及家属知情同意。

二、研究方法

1. 记录入选患者的一般临床资料： 所有患者均给予气管插管行机械通气，同时给予祛痰、补液、营养支持等对症治疗。详细记录两组患者性别、年龄、机械通气时间、血常规、基础疾病、机械通气天数等临床资料。同时对两组患者进行CPIS评分，评价患者肺部感染程度。对于VAP患者，根据血培养及药敏试验结果，选用相应抗生素进行治疗。

2. 外周血Th17细胞检测： 收集VAP组治疗前后及非VAP组清晨空腹静脉血3 ml，加入肝素抗凝及等体积淋巴细胞分离液后梯度离心，以离心半径8 cm，1 500r/min 离心15 min，分离得到外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)悬液，采用血球计数板计算PBMC数量。6孔板培养PBMC，每孔加入RPMI-1640培养基1 ml，佛波酯(50 ng/ml)、离子霉素(1 μg/ml)及莫能菌素(0.7 μg/ml)吹打混匀，孵育4 h。加入抗人CD4单抗20 μl，室温避光孵育20 min。再通过加入染色缓冲液2 ml及抗IL-17单抗20 μl，室温孵育15 min，此后以离心半径8 cm，1 500 r/min 离心10 min，弃上清，加入染色固定液1 ml，等待上机检测。

3. ELISA检测血浆IL-6、IL-17的含量: 采用ELISA法检测VAP组治疗前后及非VAP组外周血IL-6、IL-17水平，整个操作按试剂盒说明步骤进行，试剂盒由武汉博士德生物公司提供。

三、统计学方法

结　　果

一、VAP组与非VAP组外周血Th17及细胞因子水平

与非VAP组相比，VAP组患者外周血Th17细胞及细胞因子(IL-17、IL-6)显著高于非VAP组(P<0.05)，见表1、图1。

表1　两组外周血Th17及细胞因子水平

注：与非VAP组比较，aP<0.05；Th17: 辅注性T细胞；IL-17：白介素-17；IL-16: 白介素-16

图1两组外周血Th17细胞水平比较

二、VAP组患者治疗前后临床指标比较

经过有效的抗菌治疗后，VAP组患者外周血Th17细胞及细胞因子(IL-17、IL-6)水平较治疗前明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；同时治疗后VAP组CPIS评分也显著低于治疗前，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中，在治疗7 d内，VAP组患者因病情加重死亡8例，见表2。

表2　VAP组患者治疗前后外周血Th17、IL-17、IL-6及CPIS评分比较

注：与治疗前比较，aP<0.05；Th17: 辅注性T细胞；IL-17：白介素-17；IL-16: 白介素-16

三、外周血Th17细胞比例与CPIS评分相关分析

VAP组患者外周血Th17细胞比例与CPIS评分进行相关分析，结果显示两者呈显著正相关(r=0.69，P<0.01)，即外周血Th17细胞比例越高，VAP肺部感染程度越重，CPIS评分也相应升高，见图2。

图2VAP组患者外周血Th17细胞水平与CPIS评分的相关性

四、外周血Th17细胞水平对VAP早期诊断的ROC曲线分析

通过ROC曲线分析发现外周血Th17细胞水平的AUC为0.885(95%CI0.794～0.918)，其OOP分别为7.4 %，提示外周血Th17细胞比例>7.4 %，此时早期诊断VAP的精确率较高(敏感性为83.6%和特异性为89.1%)，见图3。

图3 外周血Th17细胞水平的ROC曲线

讨　　论

VAP是指机械通气超过24 h或脱机48 h内发生的肺炎，是医院获得性肺炎最常见的类型，病情常进行性加重，严重威胁患者身体健康[7]。目前，VAP的发生率及死亡率均较高，虽然其确切的发病机制仍不太清楚，但大量的研究已显示，反复的肺部炎症在VAP的发生发展过程中起着重要的作用[8]。其中，中性粒细胞及淋巴细胞的异常活化是VAP发生的关键因素。随着中性粒细胞的增加，肺部炎症越显著，病情越危重[9-10]。是什么因素导致VAP患者中性粒细胞的大量活化与聚集，其具体的机制尚不完全清楚，但目前研究显示可能与T淋巴细胞释放的炎性趋化因子的作用有关。

Th17是一类近些年来发现的淋巴细胞亚群，其主要分泌IL-17，发挥相应的效应[11]。相关研究证实，在自身免疫性疾病及炎症性疾病中，特别是在脓毒症、支气管哮喘及慢性阻塞性肺疾病等患者中，其外周血中Th17细胞比例及IL-17明显高于健康对照者，并且随着疾病严重程度的加重，Th17细胞及IL-17水平也明显增加[12]。IL-17作为重要的炎性细胞因子，其水平的增加可引起气道上皮细胞释放IL-6及IL-8等致炎因子及趋化因子的增加，从而促进中性粒细胞募集到肺部组织，引起炎症的进一步加重[13-14]。可见，Th17细胞的活化是促进炎症性疾病发生发展的重要环节之一。但是否Th17与VAP的发生发展有关，目前相关研究尚未阐明。针对VAP患者寻找一项指标，能早期的对其进行诊断，对于临床个体化治疗具有重要的意义。在本研究通过对VAP与非VAP患者外周血Th17细胞水平及相关细胞因子进行了检测，结果发现VAP患者外周血Th17细胞水平显著高于非VAP组患者，同时细胞因子IL-17和IL-6也显著较非VAP组升高，表明VAP患者体内炎症水平明显高于非VAP组。随着VAP组患者经过相应治疗后，外周血Th17细胞水平及相应细胞因子呈现明显降低趋势，表明Th17细胞水平的变化可在一定程度上反映VAP患者的治疗效果。临床上，VAP患者肺部感染程度常用CPIS评分来进行评价，其评分越高，表明患者肺部感染程度越重[15]。本研究通过相关性分析显示，外周血Th17细胞水平与CPIS评分呈显著的正相关，即外周血Th17细胞水平越高，CPIS评分也越高。进一步探讨外周血Th17细胞水平对早期诊断VAP的精确性，本研究发现以外周血Th17细胞比例>7.4%作为早期诊断VAP的界限时，诊断VAP的敏感性为83.6%，特异性为89.1%。相关研究显示，通过抑制炎症性疾病患者体内Th17细胞及其分泌的IL-17水平，可以显著降低炎症反应，改善患者临床预后[12]。针对VAP患者，通过检测外周血Th17细胞水平，其不仅可作为早期诊断VAP的有效指标，还可能为其治疗提供新的靶点。

上述研究表明，外周血Th17细胞水平能有效的对VAP患者进行早期诊断，从而为患者的早期个体化治疗提供临床依据。但由于本研究VAP患者样本量偏少，尚需要进一步扩大样本量，采取多中心联合的方式对外周血Th17细胞水平在早期诊断VAP的临床价值方面做进一步的研究。

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(本文编辑：张大春)

张鹏，周健，王耀丽，等. 外周血Th17细胞对呼吸机相关性肺炎的早期诊断价值[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(2)： 150-153.

Early diagnosis value of peripheral Th17 cells levels on ventilator associated pneumonia

ZhangPeng,ZhouJian,WangYaoli,LuHaibin,YangXuefei,MaLingyun.

DepartmentofIntensiveCareUnit,DapingHospital&InstituteofSurgeryResearch,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,ChinaCorrespondingauthor：MaLingyun,Email:malingyuncq01@163.com

ObjectiveTo study the clinical value of Th17 cell levels on the early diagnosis of ventilator associated pneumonia (VAP). MethodsA total of 510 patients, who undergone mechanical ventilation over 48 h in our hospital from April 2011 to April 2015 were enrolled in the study. According to the related infections, these patients were divided the VAP group (95 cases) and non-VAP group (415 cases). The percentages of Th17 cells were measured by flow cytometry, Serum levels of cytokines, interleukin-17 (IL-17), interleukin-16(IL-6) were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and clinical pulmonary infection score(CPIS) score were analyzed. The differences of Th17 cells levels and IL-17, IL-6 were compared and correlation with CPIS score were analyzed, which the relationship with the early diagnosis of VAP were also assessed. ResultsTh17 cells, IL-17 and IL-6 levels in VAP group were significantly higher than non-VAP group (P<0.05); After the treatment, the levels of Th17 cells, IL-17 and IL-6 levels, and CPIS score were significantly decreased in VAP group (P<0.05). The Th17 cells levels and CPIS score were positive correlated (r=0.69,P<0.01). ROC curves analysis results showed that with Th17 cell levels>7.4% considered as the boundary for diagnosis of VAP, the sensitivity was 83.6%, the specificity was 89.1%, the area under curve of Th17 cell levels was 0.885 (95%CI0.794-0.918). ConclusionThe peripheral Th17 cells levels of VAP are significantly increased, and have a good correlation with CPIS score. The Th17 cells levels can be used as an early diagnostic maker for VAP.

Ventilator associated pneumonia;Helper T cell 17;Interleukin-17;Diagnosis, early

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.02.008

国家自然科学基金青年项目(81200057)

400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所重症医学科

马凌云，Email：malingyuncq01@163.com

R563

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2015-12-05)