韩喜梅，姚　刚，满玉红，于挺敏△

(1.内蒙古自治区赤峰市医院神经内科　024000；2.吉林大学第二医院神经内科，长春 130041)



都梁软胶囊对偏头痛模型大鼠中脑CGRP及CCK表达的影响

韩喜梅1，姚刚2，满玉红2，于挺敏2△

(1.内蒙古自治区赤峰市医院神经内科024000；2.吉林大学第二医院神经内科，长春 130041)

目的研究都梁软胶囊对偏头痛模型大鼠中脑降钙素基因相关肽(CGRP)和缩胆囊肽(CCK)基因转录水平的影响，探讨其预防治疗偏头痛的作用机制。方法健康Wistar大鼠随机分4组，A为对照组，B为偏头痛组，C为都梁软胶囊对照组，D为都梁软胶囊治疗组。C、D组给予都梁软胶囊0.5 g·kg-1·d-1灌胃，A、B组大鼠灌胃给予等量容积的Tween-80。灌胃7 d后，将B、D两组大鼠造硝酸甘油型偏头痛模型，造模2 h，保存中脑标本。实时荧光定量PCR检测CGRP和CCK的转录水平。结果D组大鼠中脑CGRP 转录水平明显低于B组(0.64±0.35和 1.61±0.51，P<0.05)。C组大鼠中脑CCK 转录水平明显低于A组(0.32±0.31和1.21±0.38，P<0.05)。结论都梁软胶囊可以干预中脑CGRP和CCK的表达，从而影响内源性痛觉调制系统的功能。

偏头痛；中脑；降钙素基因相关肽；都梁软胶囊；缩胆囊肽

偏头痛是临床常见疾病，严重影响患者的生活质量，目前临床上采用的预防性治疗药物并不完全有效，并且容易产生耐受或发生不良反应[1]。偏头痛患者头痛发作若不能得到有效控制，容易发生药物滥用，同时还可能与情感障碍共病，给患者带来更严重的危害。近期一项关于都梁软胶囊治疗偏头痛的荟萃分析显示：临床上都梁软胶囊治疗偏头痛的有效率优于偏头痛一线预防性治疗药物“氟桂利嗪”[2]。目前，关于都梁软胶囊治疗偏头痛的基础研究较为薄弱，其具体机制有待于深入探讨。内源性痛觉调制系统功能异常是参与偏头痛发作的重要因素，调节内源性痛觉调制系统的功能对偏头痛的防治有重要价值[3]。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)和缩胆囊肽(cholecystokinin，CCK)是内源性痛觉调制系统中两种重要的神经肽，它们可以减弱阿片肽在中脑的镇痛效应，从而参与痛觉调节[4]。本实验以偏头痛大鼠为模型，研究了预防性给予都梁软胶囊对偏头痛发作时模型大鼠中脑CGRP和CCK基因转录水平的影响，探讨都梁软胶囊预防性治疗偏头痛的机制。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器24只健康SPF级Wistar大鼠(雌雄各半)，体质量200～220 g，购于吉林大学基础医学院动物中心，动物合格证号：SCXK(吉)2003-001。都梁软胶囊(重庆华森制药有限公司，批准文号：Z20055185)。总RNA提取试剂盒(RNAiso Reagent)、反转录试剂盒RNA [PCR Kit(AMV) Ver.3.0]、E.coli DH5α菌株、pEASY-T1载体、限制性内切酶BamH I和EcoR V、荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM，购自大连TaKaRa公司。胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒(Axygen Biosciences)。定量PCR仪(ABI PRISM 7500)。

1.2大鼠分组、药物干预及模型制备按随机区组法分为4组，每组6只大鼠：对照组(A组)、偏头痛组(B组)、都梁软胶囊对照组(C组)和都梁软胶囊治疗组(D组)。都梁软胶囊对照组和都梁软胶囊治疗组大鼠灌胃给予都梁软胶囊，剂量为0.5 g·kg-1·d-1(药物用Tween-80稀释为0.1 g/mL，剂量根据成人常规每日剂量进行换算)，A组和B组大鼠灌胃给予等容积的Tween-80。给药7 d后，B、D组皮下给予硝酸甘油注射剂(剂量为：10 mg/kg)制备实验性偏头痛模型，以出现双耳发红、前肢频繁搔头、爬笼次数增多、咬尾、往返运动等提示模型动物头部不适的症状为造模成功的指标[5]。

1.3标本采集造模2.0 h，麻醉并处死各组大鼠(腹腔注射10%水合氯醛每100克0.3 mL/100 g)，分离中脑，存于-70 ℃冰箱中备用。

1.4实时定量PCRcDNA合成：根据试剂盒说明书提取各组大鼠中脑总RNA，每一标本取总RNA 200 ng，MgCl24 μL,10×RT Buffer 2 μL，dNTP Mixture(各10 mmol/L) 2 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，Random 9 mers 1 μL，加RNase Free ddH2O至20 μL。30℃ 10 min,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min进行反转录。定量标准品制备：CGRP引物上游5′-AAG TTC TCC CCT TTC CTG GT-3′，下游5′-GGT GGG CAC AAA GTT GTC CT-3′，扩增片段长度为318 bp。CCK引物上游5′-CCC GAT ACA TCC AGC AGG TC-3′，下游5′-AAA TCC ATC CAG CCC ATG-TAG TC-3′，扩增片段长度为121 bp。PCR反应参数：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，CGRP 53 ℃(CCK 57 ℃)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。PCR产物胶回收纯化后与pEASY-T1载体连接，转化克隆宿主E.coli DH5α进行亚克隆，筛选获得目标转化子后提取质粒，经酶切和测序验证，证实克隆到的CGRP cDNA和CCK cDNA全长序列完全正确。根据所提质粒的A260计算其浓度，梯度稀释后用于绘制标准曲线。SYBR GreenⅠ实时定量PCR：20 μL反应体系中包括：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA标本2.0 μL，dH2O 6.8 μL。将CGRP(CCK)质粒标准品进行10倍系列稀释，得到不同浓度的标准品，同时进行PCR。以上各标本均做3个复孔。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，CGRP 53 ℃(CCK 57 ℃)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环，根据荧光信号记录Ct值(threshold cycle,Ct)，代入标准曲线计算绝对含量。同时设置95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s进行溶解曲线分析以确定定量准确性。

1.5统计学处理采用SPSS1 7.0统计软件进行分析处理，数据以均数±标准差表示，组间差别采用单因素方差分析和Tukey比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1CGRP、CCK基因标准品实时定量PCR标准曲线10倍系列稀释的CGRP和CCK质粒标准品制作PCR标准曲线，检测的线性范围达7个数量级。CGRP检测上限为2.7×109copy/μL，下限为2.7×103copy/μL，回归方程Ct=-2.69Log(x)+38.875，r=0.993，见图1。CCK检测上限为2.8×109拷贝/μL，下限为2.8×103copy/μL，回归方程Ct=-1.907Log(x)+35.224，r=0.953，见图2。

图1　CGRP mRNA荧光定量PCR标准曲线

2.2各组大鼠中脑CGRP mRNA的表达各组大鼠中脑总RNA(每200纳克)中CGRP mRNA拷贝数(×104copy)分别为：A组1.13±0.68；B组1.61±0.51；C组0.53±0.43；D组0.64±0.35。B组大鼠中脑CGRP 转录水平明显高于C组(q=5.242，P<0.05)；D组大鼠中脑CGRP 转录水平明显低于B组(q=4.671，P<0.05)，见图3。

图2　CCK mRNA荧光定量PCR标准曲线

a：q=5.242，P<0.05；b：q=4.671，P<0.05；CGRP：降钙素基因相关肽。

图3各组大鼠中脑CGRP mRNA表达比较

2.3各组大鼠中脑CCK mRNA的表达各组大鼠中脑总RNA(每200纳克)中CCK mRNA拷贝数(×106copy)分别为：对照组 1.21±0.38；B组1.71±0.83；C组0.32±0.31；D组1.00±0.48。B组大鼠中脑CCK转录水平明显高于C组(q=6.301，P<0.05)；C组大鼠中脑CCK转录水平明显低于A组(q=4.035，P<0.05)，见图4。

a：q=4.035，P<0.05；b:q=6.301，P<0.05；CCK：缩胆囊肽。

图4各组大鼠中脑CCK mRNA表达比较

3　讨　论

流行病学调查显示：全球患偏头痛的人口约占14.7%[6]。由Yu等[7]牵头进行的流行病学调查显示我国偏头痛患病率约为9.3%。目前临床上常用的偏头痛预防性治疗药物主要包括如下几类：钙离子拮抗剂(氟桂利嗪)、β受体阻滞剂(普萘洛尔)、抗癫痫药(丙戊酸、托吡酯)、抗抑郁药物(阿米替林)等[8]。然而，上述药物长期应用可能出现的副作用及不良反应常常限制了这些药物的临床应用。

都梁软胶囊由白芷和川芎两味中药组成，具有祛风散寒，活血通络的功效，临床用于偏头痛的治疗，取得了较为满意的效果[9]。李伟仕等[10]应用都梁软胶囊对偏头痛进行预防性治疗，发现都梁软胶囊疗效明显，并且远期疗效仍可达到64.71%。内源性痛觉调制系统对痛觉感受起着关键的调控作用，都梁软胶囊对偏头痛的治疗是否影响到内源性痛觉调制系统的功能还不清楚。本研究在制备硝酸甘油型偏头痛大鼠模型之前，连续给予都梁软胶囊7 d，观察都梁软胶囊对内源性痛觉调制系统的核心结构——中脑疼痛相关神经肽的影响，进而探讨都梁软胶囊预防性治疗偏头痛的机制。

CGRP是目前公认的与偏头痛关系最为密切的神经肽之一。研究发现，偏头痛发作时颈外静脉血中CGRP的含量增加，但同一时刻肘静脉血中CGRP的含量并无明显变化，此现象提示偏头痛发作时颅内释放CGRP增加[11]。CGRP在神经系统中具有增强突触传递的作用。动物实验发现，脊髓背角突触后神经元AMPA型谷氨酸受体与CGRP受体共表达，外源性给予CGRP预处理可以明显增加这些神经元对AMPA的放电频率，同时也发现CGRP拮抗剂CGRP8-37可以阻断这种反应[12]。当CGRP水平升高时，感觉传入信号可能被异常放大而超过疼痛的阈值，CGRP起到传递和扩大痛觉信号的作用[13]。另外，CGRP在中脑还可以减弱内源性阿片肽的镇痛效应[4]。本研究发现，都梁软胶囊预防性治疗的偏头痛大鼠中脑CGRP mRNA表达明显低于偏头痛组大鼠，说明都梁软胶囊预防性治疗可以抑制偏头痛发作时模型大鼠中脑CGRP的基因表达，这样一方面可以减弱CGRP对痛觉信息的传递作用；另一方面可以抵抗CGRP对阿片肽镇痛作用的抑制效应。

脑中与痛觉调制相关的脑区均有CCK存在，动物实验发现在神经损伤后及摄入阿片后CCK水平都会上升，提示CCK 是阿片拮抗剂，当CCK水平升高时，阿片所诱发的镇痛作用便大大减弱了，但若同时使用CCK拮抗剂，则阿片的镇痛作用增强[4]。因此，目前认为CCK在内源性痛觉调制系统中的作用主要是拮抗阿片镇痛[4,14]。本研究显示都梁软胶囊对照组大鼠中脑CCK mRNA拷贝数明显低于对照组和偏头痛组，说明都梁软胶囊可以抑制大鼠中脑CCK的基因表达，都梁软胶囊下调CCK的表达会减弱CCK对阿片镇痛的拮抗作用，从而，一定程度上增强了内源性阿片肽的镇痛效应。但研究结果并未发现都梁软胶囊治疗组大鼠中脑CCK基因表达与对照组及偏头痛组有显著性差异，说明大鼠偏头痛发作时中脑CCK基因表达并未发生明显的下调，考虑与偏头痛病理生理过程复杂有关，同时也提示都梁软胶囊镇痛机制可能与其调节CCK的表达无直接关系。

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Effects of Duliang capsule on the expression of calcitonin gene-related peptide and cholecystokinin in the midbrain of a rat migraine model

Han Ximei1,Yao Gang2,Man Yuhong2,Yu Tingmin2△

(1.DepartmentofNeurology,ChifengMunicipalHospital,Chifeng,InnerMongoliaAutonomousRegion024000,China;2.DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun,Jilin130041,China)

ObjectiveTo study the effects of Duliang capsule on the expression of calcitonin gene-related peptide(CGRP) and cholecystokinin(CCK) in the midbrain of a rat migraine model,and explored treatment effects and mechanisms of Duliang capsule on rats with migraine.MethodsA total of 24 rats were randomly divided into four groups:normal control groups(A),migraine model groups(B),Duliang capsule control groups(C) and Duliang capsule treatment groups(D).C and D were intragastrically perfused with Duliang capsule(0.5 g·kg-1·d-1).After 7 days,nitroglycerin was subcutaneously injected into the buttocks of the B and D to induce migraine.Two hours after nitroglycerin injection,the midbrain were isolated CGRP and CCK expression in midbrain were determined using SYBR Green I real-time quantitative PCR.ResultsCGRP mRNA expression was significantly lower in midbrains of rats in the Duliang capsule treatment groups compared with migraine model groups(P<0.05).CCK mRNA expression was significantly lower in midbrains of rats in the Duliang capsule control groups compared with normal control groups(P<0.05).ConclusionDuliang capsule can exhibit the expression of CGRP and CCK in the midbrain of the migraine rats.weaken the CGRP and CCK-induced inhibition of the analgesic effects of opioid peptides.

migraine disorders;mesencephalon;calcitonin gene-related peptide;duliang capsule;cholecystokinin

韩喜梅(1983-)，主治医师，硕士，主要从事慢性头痛的基础与临床研究。△

，E-mail:ytm_396@163.com。

论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.005

R747.2

A

1671-8348(2016)27-3760-03

2016-02-15

2016-04-06)