买买提艾力·哈斯木，江仁兵，白靖平，徐万龙

(1.新疆医科大学附属肿瘤医院骨与软组织肿瘤科,乌鲁木齐 830011；2.山东大学齐鲁医院，济南 250012)



论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.004

二膦酸盐对人骨肉瘤细胞诱导凋亡作用的实验研究*

买买提艾力·哈斯木1，江仁兵1，白靖平1，徐万龙2△

(1.新疆医科大学附属肿瘤医院骨与软组织肿瘤科,乌鲁木齐 830011；2.山东大学齐鲁医院，济南 250012)

目的探讨二膦酸盐对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制。方法将人骨肉瘤MG-63细胞株培养、传代后将细胞分为两组：二膦酸盐400 μg/mL干预组、生理盐水空白对照组，孵育72 h后，对两组人骨肉瘤MG-63细胞株行免疫荧光检测，观察两组细胞中凋亡因子Caspase-3、Fas的表达；行流式细胞术检测，观察两组细胞的细胞凋亡率。结果二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG-63细胞株72 h后，免疫荧光检测结果可见二膦酸盐400 μg/mL干预组细胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表达，而生理盐水空白对照组几乎见不到凋亡因子Caspase-3、Fas的表达；流式细胞术检测结果观察到二膦酸盐400 μg/mL干预组细胞的细胞凋亡率为54.00%，远大于生理盐水空白对照组的细胞凋亡率3.10%，差异有统计学意义(P<0.05)，存在明显的诱导凋亡现象。结论二膦酸盐对体外人骨肉瘤MG-63细胞株存在很强的诱导凋亡作用。

二膦酸盐类;骨肉瘤；细胞凋亡；MG-63细胞株

骨肉瘤(Osteosarcoma)是一种好发于青少年，发病率高、恶性程度高、预后差的恶性肿瘤，但目前用于骨肉瘤的化疗药物缺乏特异性、敏感性，不良反应大[1-3]。二膦酸盐(Bisphosphonates)最初用于治疗前列腺癌、乳腺癌骨转移的临床治疗，目前二膦酸盐已成为肿瘤研究的热点药物。二膦酸盐已被实验证明可对多种恶性肿瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用，但其能否对人骨肉瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用，以及其机制少见其他方面深入的报道。本文应用二膦酸盐直接作用于人骨肉瘤细胞，通过免疫荧法检测人骨肉瘤细胞中凋亡因子Caspase-3、Fas的表达，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，探讨二膦酸盐对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制，以期为二膦酸盐应用于骨肉瘤的化疗奠定实验基础和理论依据。

1　材料与方法

1.1实验细胞及主要试剂人骨肉瘤细胞MG-63购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，二膦酸盐购自瑞士Novartis Pharma Stein AG公司，批准文号：注册证号H20090259。胎牛血清(FBS)购自美国Sigma公司。DMEM高糖培养液(含青霉素和链霉素各100 U/mL)购自宝信生物制品有限公司。免疫荧光检测Caspase-3、Fas试剂购自美国Qiagen公司，流式细胞术检测试剂购自美国BD Syringe公司。

1.2细胞培养与分组细胞培养与传代：MG-63细胞培养于含体积分数10% FBS的DMEM高糖培养液，置于在体积分数5% CO2孵育箱内37℃恒温培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，PBS冲洗2次，用0.25%的胰酶消化7 min，镜下观察胞质回缩、细胞间隙增大，立即加入含血清培养液终止消化，吸管反复吹打成单细胞悬液，细胞计数，分瓶培养，取对数生长期细胞用于实验。细胞每隔3～5 d传代。细胞活力测定：细胞加入0.4%锥虫蓝，1.0～2.0 min内在倒置显微镜下计数细胞总数和死亡细胞数，镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，以活细胞的百分数代表细胞活力。细胞计数法：采用血细胞计数法。用乙醇清洁计数板及盖玻片，制备单细胞悬液用枪头加入微量细胞悬液，不要溢出盖玻片。在显微镜下，用10倍物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计数左侧和上方，不计右侧和下方。将计数结果代入公式:细胞数/毫升原液=(大格细胞总数/4)×104×稀释倍数。每孔接种5×105个MG-63细胞于96孔板中，并将细胞均分为两组：二膦酸盐(400 μg/mL)干预组、生理盐水空白对照组，孵育72 h待用。

1.3免疫荧光检测两组骨肉瘤细胞株MG-63细胞中凋亡因子Caspase-3、Fas的表达将细胞接种于盖玻片上，细胞过夜贴壁,冷丙酮固定1 min，PBS洗3次，3%BSA室温封闭30 min，加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4℃过夜，PBS洗3次，加二抗(用1%BSA稀释)闭光反应30 min，PBS洗3次，滴入DAPI，避光干燥后指甲油封片，荧光显微镜下观察两组人骨肉瘤MG-63细胞株中凋亡因子Caspase-3、Fas的表达情况。

1.4流式细胞仪检测两组人骨肉瘤MG-63细胞株的细胞凋亡率分别收集膦酸盐400 μg/mL干预组、生理盐水空白对照组作用72 h的MG-63细胞，每样本细胞数为每毫升1×105个，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。用孵育缓冲液洗涤1次，用100 μL的标记溶液重悬细胞。1 000 r/min离心5 min，沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min。上FACS-Claibur流式细胞仪检测分析。结果判断标准：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞(FITC-/PI-)，右上象限是坏死细胞为(FITC+/PI+)，而右下象限为显现凋亡细胞(FITC+/PI-)。

1.5统计学处理统计结果的处理采用SPSS19.0统计软件。计数资料用率表示，两组之间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05，以P<0.05差异有统计学意义。

2　结　果

2.1荧光显微镜下观察两组人骨肉瘤MG-63细胞株中凋亡因子Caspase-3、Fas的表达二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG-63细胞株72 h后，免疫荧光检测结果可见二膦酸盐400 μg/mL干预组细胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表达，Caspase-3阳性的细胞均发出绿色荧光，细胞核发出蓝色荧光(图1)，Fas阳性的细胞均发出绿色红光(图2)，细胞核发出蓝色荧光；而生理盐水空白对照组几乎见不到凋亡因子Caspase-3、Fas的阳性表达，只能见到细胞核发出的蓝色荧光(图3～4)。

图2　二膦酸盐干预组细胞中Fas表达(Fas-TRITC ×400)

图3　生理盐水空白对照组细胞中Caspase-3表达(Caspase-3-FITC ×400)

图4　生理盐水空白对照组细胞中Fas 表达(Fas-TRITC ×400)

图5　二膦酸盐干预组细胞凋亡图

2.2流式细胞仪检测两组人骨肉瘤MG-63细胞株的细胞凋亡率二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG-63细胞株72 h后，流式细胞仪检测结果提示：二膦酸盐干预组细胞的细胞凋亡率为54.00%(图5)，远大于生理盐水空白对照组的细胞凋亡率3.10%(图6)，差异有统计学意义(P<0.05)，存在明显的诱导凋亡现象。

图6　生理盐水空白对照组细胞凋亡图

3　讨　论

在临床上骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，在原发性骨肿瘤中发病率最高，约占35%，好发于青少年，恶性程度高，远处转移早，预后差。骨肉瘤细胞的凋亡过程是一个精确调控的过程，骨肉瘤细胞的凋亡涉及细胞内许多基因的调控，而某些基因的表达在抑制肿瘤生长、促进骨肉瘤细胞凋亡方面具有重要意义[4-7]。骨肉瘤细胞的凋亡受多种凋亡通路的调控，其中Caspase和Fas/FasL系统在这个过程中起最为关键的作用[8-9]。细胞的凋亡信号通过细胞膜受体途径(Fas/FasL)或线粒体途径传导，依次激活起始凋亡途径中的Caspase-8、Caspase-9，继而连锁激活下游转导通路和信号的关键执行分子Caspase-3，最后开启了继而骨肿瘤细胞的启动凋亡过程[10-12]。

本研究结果可见经二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG-63细胞株72 h后，细胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表达，而生理盐水空白对照组几乎见不到以上两种因子的阳性表达，提示二膦酸盐可以通过激活人骨肉瘤MG-63细胞株中的Caspase和Fas/FasL的细胞凋亡信号通路。这与文献[13-14]的研究结果相似，他们认为Fas基因是骨肉瘤细胞凋亡的关节调控基因，Fas基因在人类染色体10q区域，它所产生的小分子属于神经生长因子/肿瘤坏死因子(NGF/TNF)的I型跨膜受体蛋白。二膦酸盐可以通过诱导Fas来开启细胞程序性死亡的开始，并在人骨肉瘤细胞内不断将此信号逐级放大，将信号通过相应受体导入细胞核，从而导致肿瘤细胞的凋亡。这个结果也被Yang等[15]所证实，他认为数字Caspase本质属于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，目前有14种Caspase家族成员发现，以上Caspase家族成员均具有蛋白质酶切作用，其中在骨肉瘤凋亡过程中其最重要的便是Caspase-3蛋白。Caspase-3位于凋亡通路的下游，可被上游的同家族蛋白Caspase-8、Caspase-9所激活，是细胞凋亡的具体执行者。

本研究结果提示，二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG-63细胞株72 h后，细胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表达，表明在骨肉瘤细胞的凋亡过程中，Fas、FasL和Caspase家族在细胞凋亡过程中分别起着发出凋亡死亡信号、感知并转导信号且逐级放大至细胞内部、接受信号激活级联反应并产生效应等一系列作用，这与赵意华等[16]的研究结果相同。此系统是细胞凋亡的最主要途径之一，其中Caspase蛋白的表达是各种细胞凋亡机制的最后共同通路，在细胞的信号传递过程中处于重要地位。因此作者认为药物治疗恶性骨肉瘤过程中，Caspase和Fas/FasL系统的激活是导致骨肉瘤细胞凋亡最关键的一环。

本文研究结果提示，400 μg/mL的二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG-63细胞株72 h后细胞凋亡率为54.00%，表示临床上实用小剂量的二膦酸盐即可对骨肉瘤有很好的治疗作用，提示二膦酸盐可作为新一类敏感而有效、且全身不良反应小的药物应用于临床。因此作者认为这就可以减少以下临床问题：现有化疗药大多为细胞毒性药物，无特异性，敏感性不高，新辅助化疗的大剂量长期联合用药不良反应大，容易出现骨髓抑制、心肌、肾脏、性腺等损害，肿瘤的耐药性等问题没有解决，化疗药物的敏感性评价较困难等等。而二膦酸盐低剂量即可有很好的体外骨肉瘤抑制作用，且敏感性高，非细胞毒性药物，全身不良反应小。

本研究结果显示，二膦酸盐对体外人骨肉瘤MG-63细胞株存在很强的诱导凋亡作用，且结合二膦酸盐处理后的人骨肉瘤MG-63细胞株凋亡因子Caspase-3、Fas大量表达，初步证实二膦酸盐有抑制骨肉瘤细胞生长，促进凋亡的作用；而且作者认为二膦酸盐是通过上调人骨肉瘤MG-63细胞株中促凋亡基因Fas的表达，所以骨肉瘤细胞中的Fas/FasL和Caspase介导的死亡信号转导系统则可能是其作用机制之一。

二膦酸盐如果被证实对人骨肉瘤细胞具有诱导凋亡作用，再结合其亦能抑制因破骨活性增加而导致的骨吸收，那在临床上即可杀灭肿瘤，又可抑制骨肉瘤的溶骨性破坏,具有以上双重特点的二膦酸盐将在人骨肉瘤的治疗中具有极高的临床应用价值。

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Apoptotic effects of bisphosphonate inosteosarcoma MG-63 cells in vitro*

Maimaitiaili1,Jiang Renbing2,Bai Jingping2,Xu Wanlong2△

(1.DepartmentofBoneandSoftConnectiveTissueTumor,AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830011,China;2.QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China)

ObjectiveTo observe the effects of bisphosphonate on the inhibit proliferation and the apoptosis effect in osteosarcoma MG-63 cells in vitro,explore the phosphonic acid salt of bone sarcoma cells,induce apoptosis and its possible mechanism.MethodsSixty three osteosarcoma MG-63 cells were cultured in vitro.After treated with bisphosphonate 400 μg/mL,without bisphosphonate but normal saline,they were incubated 72 h after the application of the two group cell immunofluorescence test;then observe the expression of apoptosis factors Caspase 3 and Fas;Flow cytometry detection line was used to detect the osteosarcoma cell line MG-63 cells apoptosis rate of each group.Results72 h after treatment with bisphosphonate,the expression of apoptosis factor of Caspase-3 and Fas in osteosarcoma MG-63 cells were strongly expressed,and it was observed by immunofluorescent assay,while in blank control group,we could barely see the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Fas;Flow cytometry test results showed that two phosphonic acid salt 400 μg/mL intervention group cell apoptosis rate was 54.00%,far more than normal saline blank control group,of which the apoptosis rate was 3.10%,the difference was statistically significant (P<0.05),there is an obvious phenomenon of induced apoptosis.ConclusionBisphosphonate has a strong apoptotic effects of bisphosphonate in osteosarcoma MG-63 cells in vitro.Bisphosphonate can inhibit osteolysis of osteosarcoma MG-63 cells via regulating the expression of Caspase-3,Fas in osteosarcoma MG-63 cells.Bisphosphonate may serve as a potential therapeutic agent for treatment of osteosarcoma.

bisphosphonates;osteosarcoma;apoptosis;MG-63 cells

国家自然科学基金资助项目(81360276)；新疆维吾尔自治区卫生厅青年科技人才专项科研资金(2012Y07)；新疆医科大学创新基金(XJC201157)。作者简介：买买提艾力.哈斯木(1978-),副主任医师,硕士,主要从事骨与软组织肿瘤方面研究工作。△

，E-mail:xuwanlong20082008@163.com。

R681.2

A

1671-8348(2016)27-3757-03

2016-02-10

2016-04-06)