肖　辉,刘丽娟,李冰宁，杜建萍

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100041)



酿造食醋与配制食醋成分鉴别方法研究

肖辉,刘丽娟,李冰宁，杜建萍

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100041)

本研究通过测定市场中18个配制食醋、90个酿造食醋中的有机酸、游离氨基酸的含量,利用主成分分析方法对检测结果进行分析,建立了鉴别酿造食醋和配制食醋的方法。结果表明:酿造食醋的乳酸含量在500～15000 mg/kg之间,配制食醋乳酸含量在0～500 mg/kg之间,差异明显;酿造食醋中的游离氨基酸种类和含量都明显高于配制食醋;主成分分析结果表明,食醋样品可明显分为固体发酵食醋与配制食醋两大类,因此,通过检测食醋中乳酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸的含量,对主成分分析法作了重要贡献,可以有效区分酿造和配制食醋,达到鉴别市场上标称的酿造食醋的真伪的目的。

食醋鉴别,乳酸,有机酸,游离氨基酸,主成分分析

食醋是一种古老的酿造调味品,在中国,上溯到西周时期就用醋来调味,而北魏时期的《齐民要术》中就收纳了22种制醋方法[1]。根据工艺流程,可将醋分为酿造食醋和配制食醋两大类。其中酿造食醋根据发酵工艺不同,可分为固态发酵食醋、液态发酵食醋;配制食醋是以酿造食醋为主体,与冰乙酸、食品添加剂等混合配制而成的调味食醋。酿造食醋与配制食醋无论在生产工艺上、生产成本上、营养价值上、口感风味上都有很大不同。酿造醋以酸味纯正、香味浓郁、色泽鲜明占优势。因此,厨房中常见的醋大都是酿造醋,如香醋、陈醋和熏醋等,此外还有一些饮用果醋。但是因为生产成本、消费者接受程度、口感等各方面原因,食醋市场上仍然存在着以配制食醋冒充酿造食醋的情况。配制食醋在主要指标乙酸含量上与酿造食醋相仿,难以通过传统的理化指标进行鉴别,因此,建立和完善行之有效的鉴别真伪的方法刻不容缓。

近年来,随着化学计量学和计算机科学的发展,人们越来越多地倾向于用模式识别方法结合各种化学分析方法解决食品分类和质量鉴别的难题。在国外,采用各种仪器分析方法包括传感器分析[2-3],离子选择电极[4],原子吸收光谱[5],气相色谱[6-9]。裂解质谱[10-11]等测定食醋中的一些化合物或醋的一些物理化学性质,结合化学计量学方法解析,对食醋进行分类和质量鉴别。国内学者也采用传感器[12-13]、紫外光谱[14-15]、近红外光谱[16-18]、原子吸收法、高效液相色谱等与化学计量学结合对食醋进行分类或理化指标分析。

食醋的检测指标繁多,在寻找特征指标时,需要用简便、准确和有效的方法从指标中筛选出有效的特征指标。本文依据样品中酿造食醋与配制食醋的营养成分数据的分析结果,结合化学计量学,采用主成分分析方法对食醋进行聚类,得到了质量相近的物质聚为一类的结论,并找出对聚类分析贡献较大的营养指标,从而寻找出酿造与配制食醋的区别性指标。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

本研究主要在北京市海淀、朝阳、房山、丰台、门头沟、石景山、通州、顺义、宣武9大区县中的共计30个大型集贸市场、超市、连锁店以及批发、零售市场抽取样品108个,其中有标称酿造食醋90个,配制食醋18个。样品产地涉及北京、天津、山西、江苏、上海、香港等地区的近百家生产企业。

H3PO4(分析纯)、NaH2PO4(分析纯)、亚铁氰化钾(分析纯)、ZnSO4(分析纯)、乙酸(分析纯)、甲醇(色谱纯),中国医药(集团)上海化学试剂公司;草酸、丙酮酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸均为色谱纯,Sigma-Aldrich(上海)公司。浓盐酸:优级纯、26 mol/L盐酸(浓盐酸与水1∶1混合而成)、苯酚(需重蒸馏)、混合氨基酸标准液(0.0025 mol/L)、缓冲液(pH分别为2.2,3.3,4.0,6.4的柠檬酸钠缓冲液)、茚三酮溶液、高纯氮气(纯度99.99%)、冷冻剂(市售食盐与冰按1∶3混合)。

SevenEasy实验室pH计、电子天平Mettler Toledo仪器(上海)有限公司;高效液相色谱DIONEX公司;样品预处理柱Sep-Pak C18Cartridge美国Waters公司、真空泵、恒温干燥箱、水解管(耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管,体积20～30 mL)、真空干燥器(温度可调节)、氨基酸的自动分析仪。

1.2实验方法

1.2.1有机酸含量测定样品处理:取5 mL醋样于100 mL容量瓶中,分别加入2 mL亚铁氰化钾(106 g/L)和2 mL ZnSO4(300 g/L);摇匀后用去离子水定容,静止沉淀1 h后用双层滤纸过滤,滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤,滤液再用Sep-PakC18固相小柱进行处理。固相小柱采用甲醇进行活化,用超纯水将甲醇洗净,然后将样品溶液用小柱进行处理。处理后的溶液采用HPLC进行有机酸分析。色谱峰以保留时间和样品加标定性,将各种有机酸标准溶液在同样的色谱条件下进样,绘制标准曲线,采用峰面积外标法定量。

色谱分析条件:色谱柱,Waters Atlantis dC18,5 μm,4.6 mm×150 mm;柱温30 ℃;流动相:20 mmol/L NaH2PO4,用H3PO4调pH至2.7;进样体积10 μL;流速0.7 mL/min,检测器UV210 nm。

1.2.2游离氨基酸含量测定样品处理:样品采集后用均质器均质。

称样:准确称取一定量样品,精确到0.0001 g。将称好的样品防于水解管中。

水解:在水解管内加6 mol/L盐酸10～15 mL,加入新蒸馏的苯酚3～4滴,再将水解管放入冷冻剂中,冷冻3～5 min,再接到真空泵的抽气管上,抽真空(接近0 psi),然后充入高纯氮气;再抽真空充氮气,重复三次后,在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在(110±1)℃的恒温干燥箱内,水解22 h后,取出冷却。打开水解管,将水解液过滤后,用去离子水多次冲洗水解管,将水解液全部转移到50 mL容量瓶内,用去离子水定容。吸取滤液1 mL于5 mL容量瓶内,用真空干燥器在40～50 ℃干燥,残留物用1～2 mL水溶解,再干燥,反复进行两次,最后蒸干,用1 mL pH2.2的缓冲液溶解,供仪器测定用。

测定:准确吸取0.200 mL混合氨基酸标准,用pH2.2的缓冲液稀释到5 mL,此标准稀释浓度为5.00 nmol/50 μL,作为上机测定用的氨基酸标准,用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。

1.2.3数据分析为研究食醋的品质特征,本研究分别以8种有机酸含量的百分数、10种游离氨基酸浓度含量作为变量,采用Excel软件对108个样品的有机酸数据以及游离氨基酸数据根据样品包装标签进行归类整理,并根据氨基酸总含量对样品进行排序。整理后编号1～18号样品为配制食醋样品,编号19～108样品为酿造食醋样品。

研究以8种有机酸和10种游离氨基酸的浓度作为变量,不同发酵类型作为样本集,通过Unscrambler X软件对数据进行主成分分析。样本包含18个配制食醋、73种固态发酵食醋、17种液态发酵食醋。

2　结果与讨论

2.1理化指标分析

2.1.1有机酸含量分析食醋中的有机酸主要是由于食醋发酵过程中存在的醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物通过丙酮酸或三羧酸循环形成,从而赋予食醋酸味柔和、回味绵长的口感特点。食醋在酿造过程后期添加乳酸菌与酵母菌共发酵,提高食醋中含氮量及增加不挥发酸的比例,并重视强化陈酿后熟阶段,改善食醋风味。酿造食醋中含有多种多样的有机酸,有机酸的多样性是构成食醋风味的重要物质基础之一。食醋中有机酸分为挥发酸和不挥发酸两种,其中挥发酸以乙酸为主,是食醋酸味的主要来源,乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸为不挥发酸,能够调节食醋的酸味,使食醋口感更加柔和。本研究以乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丙酮酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸8种有机酸作为研究指标，具体结果见图1。

图1　食醋中有机酸含量Fig.1　The content of organic acids in vinegar注:1～18配制食醋,19～35液体发酵食醋,36～108固体发酵食醋,图2同。

由图1可知酿造、配制食醋所含有机酸主要以乙酸和乳酸为主,它们是食醋中主要的酸性物质,占总有机酸的75%以上。配制食醋和酿造食醋的各种有机酸含量有明显差异,其中酿造食醋的乳酸含量范围远高于配制食醋,18个配制食醋样本的乳酸含量大多在0～500 mg/kg之间,90个酿造食醋样本的乳酸含量大多在500～15000 mg/kg之间。另外,酿造食醋的有机酸相比于配制食醋种类更加丰富,丙酸、甲酸、丙酮酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸的含量明显高于配制食醋。

2.1.2游离氨基酸含量分析作为影响食醋风味物质的游离氨基酸,同样来源于食醋发酵过程中微生物对粮食中氮的代谢。酿造食醋中具有丰富的氨基酸组分,而配制食醋中几乎不含氨基酸,可通过氨基酸态氮含量分析来鉴别酿造食醋和配制食醋。为研究配制食醋、液态发酵食醋和固态发酵食醋中的游离氨基酸含量的差异,本研究对18个配制食醋、17个液态酿造食醋和73个固态酿造食醋样本中的包括脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸等10种氨基酸进行分析,结果如图2所示。

图2　食醋中游离氨基酸含量Fig.2　The contents of free amino acids in vinegar注:PRO(脯氨酸),ARG(精氨酸),HIS(组氨酸),LYS(赖氨酸),PHE(苯丙氨酸),TYR(酪氨酸),LEU(亮氨酸),ILE(异亮氨酸),MET(蛋氨酸),VAL(缬氨酸),ALA(丙氨酸),GLY(甘氨酸),GLU(谷氨酸),SER(丝氨酸),THR(苏氨酸),ASP(天冬氨酸)。

由图2可知,在配制食醋中未检测到游离氨基酸,而液态和固态酿造食醋中含有丰富的游离氨基酸,其中谷氨酸的比例较高,很有可能是厂家添加了谷氨酸钠(味精)调味剂的缘故;而固态发酵食醋相比于液态发酵食醋,还含有7种人体不能合成的必需氨基酸:苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。天冬氨酸和谷氨酸是主要的呈鲜氨基酸,苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸是主要的甜味氨基酸,食醋的甜、鲜就是依靠这几种氨基酸来体现的。

2.2主成分分析

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一种将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法,其中心思想是将数据降维,以排除众多化学信息共存中相互重叠的信息。其具体处理方法是将原变量进行转换,使少数几个新变量成为原变量的线性组合,同时,这些变量要尽可能多的表征原变量的数据结构特征而不丢失信息。主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)的中心思想是将数据降维,以排除众多化学信息共存中相互重叠的信息。以8种有机酸、16种游离氨基酸含量作为变量,选取18个配制食醋、73个固态发酵食醋、17个液态发酵食醋作为样本集,进行主成分分析。

图3a得分图表示的是经过降维后食醋样本在二维空间的分布情况。图中横坐标表示每一个样本的第一主成分得分值,纵坐标表示每个样本的第二主成分得分值,其中主因子1(PC1)解释了总变异的67%,主因子2(PC2)解释了总变异的20%。配制食醋在PC1的分布范围是0.24～0.28,有明显的聚类趋势,固态发酵食醋在PC1的分布范围是-0.53～0.15,虽然聚类趋势不甚明显,但是与配制食醋距离较远。液态发酵食醋的聚类趋势不明显,在PC1的-0.20～0.28范围内均有分布。液态发酵食醋的有机酸组成和游离氨基酸含量比固态发酵食醋少很多,有些甚至与配制食醋类似。

图3　食醋的PCA得分图(a)和主成分载荷图(b)Fig.3　The PCA score plot(a)and Loading plot(b)of vinegar

每一个主成分都是原变量的线性组合,这些组合的系数称为载荷,一般用Loading表示,载荷反映的是变量与主成分的相关性,它代表在主成分中原来各个变量的权重,载荷的大小可以表明各变量的影响程度。图3b是PCA的主成分载荷图,分内外两个椭圆,外椭圆代表方差100%,内椭圆代表方差50%,内外圈间的数据代表对分类贡献显著的变量。从主成分载荷图中可以看出谷氨酸、乳酸距离外椭圆较近,说明酿造食醋和配制食醋的主要差异在乳酸比例及谷氨酸含量上。其余显著的变量有丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸。变量在载荷图的象限分布与得分图的样品的象限分布存在相干性,PC1上乙酸质量百分数的载荷比较大,乳酸质量百分数则起到相反的作用,可认为乳酸质量百分数对区分酿造食醋的贡献比较大。即发酵食醋与乳酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等游离氨基酸含量相关。

图4　固态发酵食醋与配制食醋的主成分分析结果Fig.4　The PCA of Solid-state fermentation vinegar and blended vinegar注:(a)得分图,(b)主成分载荷图。

本研究采用的液态发酵食醋的样本量较小,但PCA得分却很分散,一部分与固态发酵食醋指标相当,另外一部分样本与配制食醋指标类似。为了更清晰地辨别酿造食醋与配制食醋的品质差异,将液态发酵食醋从样本库中剔除,对固态发酵食醋与配制食醋样本进行主成分分析,结果如图4所示。图4a为固态发酵食醋和配制食醋降维后在二维空间的分布情况,其中主因子1(PC1)解释了总变异的82%,主因子2(PC2)解释了总变异的10%。固态发酵食醋与配制食醋有着明显的界限。图4b为变量的主成分载荷图,乙酸质量百分数、乳酸质量百分数、大部分氨基酸是与主因子有显著相关的变量,其中PC1上乙酸百分数、乳酸百分数载荷情况与图3b中PC1载荷相似,依据相同原理分析得乳酸含量对区分配制食醋和酿造食醋的贡献较大。丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸等游离氨基酸在PC2上载荷较大,可认为游离氨基酸在区分酿造食醋和配制食醋上也有贡献。其余的游离酸(柠檬酸、丙酸、甲酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸)和组氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、酪氨酸变量对主因子贡献较小。与图3b相比,谷氨酸的载荷明显下降,这是由于液态发酵食醋样本添加谷氨酸较多,去除液态发酵食醋样本后,固态发酵食醋样本整体氨基酸比例均衡,反映了真实样本情况。

3　结论

根据对食醋中有机酸、游离氨基酸数据的统计分析中得出的结论:无论是酿造食醋还是配制食醋,乙酸含量均占有机酸含量的主体地位。酿造食醋乳酸含量在500～15000 mg/kg之间,配制食醋含量在0～500 mg/kg之间。因生产工艺的不同,酿造食醋中除了含有丰富的乙酸、乳酸外,相对于配制食醋,还有更丰富游离氨基酸,以提高酿造食醋的特殊风味组成。PCA分析结果建议将乳酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸等作为辨别酿造食醋和配制食醋的检测指标,同时也可用其评定食醋的优良品质。

本文研究结果有助于规范生产企业商品标识,杜绝企业以次充好,避免消费欺诈,保障消费者合法利益,防止企业间以非法降低成本为手段的不正当竞争行为,提高食品安全执法部门的执法技术水平及监管力量。

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Analysis of characteristic components in fermented vinegar and blended vinegar

XIAO Hui,LIU Li-juan，LI Bing-ning,DU Jian-ping

(Beijing Municipal center for food safety monitoring and risk assessment,Beijing 100041,China)

To establish a method for identifying fermented vinegar and blended vinegar by determination of the contents of organic acid and free amino acid in 18 samples of blended vinegar,90 samples of fermented vinegar from the market,through a Principal Component Analysis(PCA)method and based on the analysis of the determination results. Results showed that:fermented vinegar had a content of lactic acid in the range from 500 to 15000 mg/kg,and the blended vinegar had a content of lactic acid in the range from 0 to 500 mg/kg. The difference was enormous. The types and contents of the free amino acid in fermented vinegar were significantly higher than that of blended vinegar. Therefore,fermented vinegar and blended vinegar can be distinguished effectively by determination of the contents of lactic acid,alanine,isoleucine,leucine,valine,threonine,serine,and glycine in the vinegar,so as to achieve the purpose of identifying the authenticity of the nominal fermented vinegar sold in the market.

vinegar identification;lactic acid;organic acid;free amino acid;Principal Component Analysis(PCA)

2015-12-16

肖辉(1981-),男，本科，工程师，研究方向：食品检验，E-mail:aa311228@126.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)17-0308-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.051