徐　敏,赵　莉，杜金城,于上富,丁秀云,霍贵成

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)



益生菌混合物通过抑制NF-κB信号通路发挥抗溃疡性结肠炎功效的研究

徐敏,赵莉，杜金城,于上富,丁秀云,霍贵成*

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

本文从NF-κB信号通路出发,探讨益生菌混合物对人工诱发溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用,为治疗人类肠炎提供一种安全可靠的方法。给予溃疡性结肠炎小鼠一定剂量的益生菌混合物,通过Western-blotting、ELISA实验法,分别测定小鼠组织及血清中关键标志物中的表达水平。结果表明:与肠炎空白组小鼠相比,益生菌联合疗法使UC小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低(p<0.05),并降低NF-κB的蛋白表达,增加IκB的蛋白表达。益生菌混合物通过抑制NF-κB信号通路的活化从而发挥抗溃疡性结肠炎功效,益生菌混合物抑制了NF-κB与IκB的分离,阻塞游离的NF-κB进入细胞核,从而无法调控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的表达,最终抑制机体过度的活化。益生菌混合物对溃疡性结肠炎具有较好的治疗作用,具有应用于临床医学的潜力。

溃疡性结肠炎,益生菌,NF-κB信号通路

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病理漫长、反复发作的炎症性疾病,其临床表现为腹泻,黏液脓血便,腹痛,里急后重等,多呈反复发作的慢性病程[1-2]。目前溃疡性结肠炎的病因与发病机制尚不十分清楚,以往研究主要集中于遗传易感性和免疫异常等方面。最近有研究显示,宿主肠道菌群改变、代谢表型改变以及NF-κB信号通路失调很可能是导致溃疡性结肠炎发生和发展的关键因素。

研究表明,许多益生菌具有增强机体免疫力、促进胃肠道消化以及预防治疗结肠癌等功效[3-4]。它们可与有害菌通过竞争位点的方式调节肠道菌群平衡;同时,益生乳酸菌还能产生抑菌物质,从而抑制有害菌的增殖。植物乳杆菌可以通过上调IFN-γ,并且促进Th1型 CD4细胞分化来增强宿体免疫力从而发挥抗肿瘤功效[5],而且其可通过抑制NF-κB信号通路可以发挥抗炎症功效,这种功效在不同年龄段的小鼠中差异显著[6]。值得关注的是,植物乳杆菌能改善不同年龄段人群的肠道健康,然而该功效与益生菌的摄入量和在胃肠道的定植相关[7]。此外,嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌以及双歧杆菌等也在增强健康小鼠的肠道黏膜免疫方面发挥了一定的作用,而且混合菌的效果更为明显[8]。

在团队之前的研究中,王婷婷、周晶等人已筛选出的瑞士乳杆菌KLDS 10010、嗜酸乳杆菌KLDS 20010、植物乳杆菌KLDS 00170,并证实了三株菌株的耐胃酸、耐肠液及耐胆盐能力,而且,瑞士乳杆菌KLDS 10010、嗜酸乳杆菌KLDS 20010、植物乳杆菌KLDS 00170单一菌株存在抗肠炎的潜能,但单菌的作用效果与前人的研究存在一定差距[9-10]。因此,本文将瑞士乳杆菌KLDS 10010、嗜酸乳杆菌KLDS 20010、植物乳杆菌KLDS 00170三种菌株混合,对人工溃疡性结肠炎小鼠进行灌胃,从小鼠病理学状态,免疫学状态等角度探讨益生菌联合疗法对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用,旨在探寻一种新型的治疗人类溃疡性结肠炎的方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

瑞士乳杆菌KLDS 10010、嗜酸乳杆菌KLDS 20010、植物乳杆菌KLDS 00170乳品工程教育部重点实验室微生物保藏中心。

BALB/c小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司;IL-1β提取试剂盒,IL-6试剂盒,TNF-α试剂盒武汉博士德生物科技有限公司;NF-κB、IκB多克隆抗体三塔生物公司;甲醛溶液天津博迪化工股份有限公司。

电子显微镜Motic公司;注射器江苏治宇医疗器械有限公司;液氮罐成都金凤液氮容器有限公司;眼科解剖盒沈阳市久鸣铝制品厂。

1.2实验方法

1.2.1益生菌混合物的制备测定瑞士乳杆菌KLDS 10010、嗜酸乳杆菌KLDS 20010、植物乳杆菌KLDS 00170的生长曲线,选取稳定期初作为取菌时间点,并且采用梯度平板计数法对三株菌到达稳定期初时的菌数进行计量。根据预实验结果,对UC小鼠的灌胃量为3×108CFU/20 g(混合菌数/小鼠体重)时,具有较好的抗溃疡性结肠炎潜力;按照1∶1∶1,则每只溃疡性结肠炎小鼠对三株菌的需求量均为1×108CFU,根据平板计数结果,则瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌应分别取瑞士乳杆菌菌液0.96 mL,嗜酸乳杆菌菌液0.5 mL,植物乳杆菌菌液0.19 mL时,三株菌稳定期初时的菌数为1×108CFU;然后离心取菌泥,分别重置于0.1 mL PBS中,4 ℃冰箱保存,用时震荡混合,用于每只小鼠的灌胃剂量。

1.2.2动物模型的建立将64只BALB/c雌鼠随机分成4组,I完全空白组(20只)、Ⅱ肠炎空白组(20只)、Ⅲ SASP组(12只)和Ⅳ益生菌组(12只)。将3%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶于水瓶中,让Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组小鼠自由饮用7 d,以诱发实验性溃疡性结肠炎小鼠模型,然后第8 d,分别解剖完全空白组、肠炎空白组小鼠8只;然后以小鼠表观状况、病理学等为指标,验证小鼠溃疡性结肠炎模型是否建立成功。其中,I完全空白组小鼠饮用灭菌蒸馏水。

1.2.3实验设计本研究实验设计如下:Ⅰ完全空白组(20只):正常饮食,无特殊处理;II肠炎空白组(20只):建模后,按照0.3 mL PBS/只进行灌胃,灌胃持续4周,灌胃频率1次/2 d;Ⅲ SASP组(12只):DSS造模后,按照0.0092 g SASP溶液/0.3 mL PBS/只进行灌胃,灌胃持续4周,灌胃频率1次/2天;Ⅳ益生菌组(12只):造模后,按照3×108CFU/0.3 mL PBS/只进行灌胃,灌胃持续4周,灌胃频率1次/2天。灌胃期间每天记录小鼠体重、粪便性状、毛发情况、隐血等[11];灌胃结束后,每组分别处死小鼠8只,摘眼球取血,并取小鼠结肠组织;并对小鼠结肠组织行HE染色,记录病理学指标图片;每组剩余的小鼠进行后续观察,2周后同上进行处理。本研究实验设计图如图1。

图1　实验方案Fig.1　The experimental design in this study

1.2.4小鼠病理学状况的观测灌胃结束后,各组随机选取待解剖小鼠,对其腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉(6 mL/kg),固定于解剖台上,眼球取血分离血清,脱颈处死小鼠,然后沿腹部正中切口,将结肠从盲肠、直肠中间剪开,快速剖取结肠,沿着肠系膜剪开,取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段,并于结肠末端(距肛门1 cm)处剪取0.5 cm长的结肠,福尔马林浸泡,行HE染色以做病理检查[12]。

1.2.5小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量的测定灌胃结束后,各组随机选取待解剖小鼠,对其腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉(6 mL/kg),固定于解剖台上,眼球取血,室温自然凝固1 h后,离心,取血清,待所有样品收集完后分别用细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)ELISA试剂盒检测[13]。

1.2.6小鼠结肠NF-κB、IκB蛋白的表达本研究直接测定与NF-κB信号通路密切相关的两种蛋白,NF-κB、IκB的蛋白表达情况,从两种蛋白表达的角度出发,间接研究益生菌混合物对机体炎性情况的改变[14]。灌胃结束后,各组随机选取待解剖小鼠,对其腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉(6 mL/kg),固定于解剖台上,眼球取血后,取结肠组织,液氮速冻后转移到-80 ℃冰箱保存,然后用Western-blotting进行检测。

1.3统计学分析

实验结果经SPSS 13.0统计软件分析,两两比较采用Duncan法。实验结果采用Mean±SD表示,p<0.05为差异有显著性意义。

2　结果与讨论

2.1溃疡性结肠炎小鼠模型的验证

建模后肠炎空白组小鼠表观状态不佳,具体表现在小鼠目光呆滞、毛发暗沉卷曲,有羌毛现象,见图2a;并且,肠炎空白组小鼠尾根处有血斑,说明小鼠有显性便血现象,见图2b;由HE染色图(见图2c)可知,肠炎空白组相对于完全空白组HE染色图,小鼠结肠组织,肠黏膜萎缩,黏膜表面钝化,隐窝破坏,结构不完整,急性溃疡性结肠炎模型建立成功,可进行下一步治疗实验。

图2　溃疡性结肠炎小鼠症状Fig.2　Clinical symptoms of UC mice

2.2益生菌对溃疡性结肠炎小鼠病理学的影响

为期4周的混合益生菌治疗后,解剖小鼠,取其结肠组织,进行苏木素-伊红染色(HE染色),肠炎空白组、益生菌组、SASP组、完全空白组的病理见图3。

图3　小鼠HE染色图Fig.3　The HE staining picture of different groups mice注：a为肠炎空白组小鼠,b为益生菌组小鼠,c为SASP组小鼠,d为完全空白组小鼠,×4倍。

由图3可知,肠炎空白组小鼠,肠黏膜萎缩,黏膜表面钝化,隐窝破坏,基本处于肠黏膜屏障失衡状态(3-a);经过两个疗程的益生菌混合疗法治疗之后,益生菌组小鼠肠黏膜细胞排列基本整齐,肠黏膜结构完整,无组织坏死现象(3-b),说明三株益生菌联合可以很好的修复溃疡性结肠炎小鼠的肠黏膜损伤;并且与SASP组、完全空白组小鼠HE染色图相比,无明显的差异,说明三株益生菌联合具有很好的抗溃疡性结肠炎作用。

2.3益生菌对小鼠血清细胞因子水平的影响

UC与炎性细胞水平密切相关。当机体受到外界刺激(如脂多糖、IL-1β、IL-6、TNF-α)时,NF-κB会与IκB分离,游离的NF-κB将进入细胞核,从而调控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的表达,从而活化机体NF-κB信号通路,迫使机体处于持续的活化状态,过多的炎性细胞因子会引起机体炎症,从而导致溃疡性结肠炎等炎症性疾病[15]。因此,选取IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子为指标,研究益生菌混合物对人工溃疡性结肠炎小鼠的作用。用酶标仪在450 nm处检测细胞因子反应板的OD值。在平行标准品OD值中选取一组线性相关性较大的点建立标准曲线方程。根据细胞因子标准曲线,得出灌胃结束后小鼠血清细胞因子水平含量表见表1。

表1　灌胃结束后小鼠血清细胞因子水平(X±SD)

注:单位为pg/mL;各组均与肠炎空白组进行显著性分析,显著水平p<0.05。

由表1可知,从IL-1β角度来看,肠炎空白组小鼠血清中IL-1β含量相对于其他组,其含量显著较高,可能是由于患溃疡性结肠炎,促使机体持续活化,从而促进IL-1β的高度表达;而经过混合益生菌的联合治疗,使溃疡性结肠炎小鼠血清中IL-1β含量显著降低,并于SASP组小鼠此种细胞因子含量无显著的差异,说明混合益生菌可以显著降低机体细胞因子IL-1β的水平。从IL-6角度来看,肠炎空白组小鼠血清细胞因子IL-6的水平与益生菌组、SASP组及完全空白组细胞因子水平有显著差异,说明益生菌及SASP处理均可以降低机体此种细胞因子水平,其中,益生菌组小鼠与SASP组小鼠此种细胞因子水平差异不显著,说明益生菌联合能达到市面上传统治疗溃疡性结肠炎的方法。从TNF-α角度来看,肠炎空白组小鼠血清TNF-α水平较高,经过2个疗程的治疗之后,益生菌组及SASP组小鼠血清TNF-α水平显著降低,说明3株益生菌联合疗法可显著降低血清炎性因子水平。表明,小鼠机体在受到造模物质——葡聚糖硫酸钠盐(DSS)刺激后会产生一定的免疫调节反应,分泌大量的细胞因子,但是随着益生菌的灌胃处理,小鼠肠道NF-κB信号免疫机制遭到破坏,抑制了相关细胞因子的表达及翻译过程[16]。

2.4益生菌对小鼠NF-κB信号通路两种关键蛋白表达情况的影响

不同组小鼠进行为期4周的不同疗法治疗后,利用Western-blotting分析检测结肠内NF-κB p65,IκB蛋白的表达情况。如图4所示,发现肠炎空白组小鼠肠道的NF-κB p65蛋白表达量较高,而IκB的表达较低;经过对UC小鼠两个疗程的益生菌混合治疗后,发现小鼠肠道的NF-κB p65蛋白表达量显著降低,而IκB的表达显著增高。人工模型UC小鼠结肠组织中NF-κB p65蛋白表达量较高,而IκB的表达较低,说明过多游离的NF-κB p65进入细胞核参与细胞因子的调控,从而引起机体的持续炎症反应;而经过对UC小鼠两个疗程的益生菌混合治疗后,小鼠肠道的NF-κB p65蛋白表达量显著降低,而IκB的表达显著增高,说明3株益生菌可以抑制NF-κB p65与IκB的分离,从而,游离的NF-κB p65蛋白表达量显著降低;益生菌混合物通过抑制NF-κB免疫信号通路来发挥抗溃疡性结肠炎能力。

图4　不同组小鼠结肠蛋白Western-blotting表达情况Fig.4　Western-blotting of colon from different group mice were analyzed注；A代表肠炎空白组,B代表正常空白组,D代表益生菌组,E代表SASP组。

3　结论与讨论

本实验建立溃疡性结肠炎小鼠模型,以小鼠病理学状态及免疫学状态为指标,研究3株益生菌联合对人工溃疡性结肠炎小鼠的作用,得出3株益生菌可显著改善UC小鼠的病理学损伤,并通过抑制NF-κB信号通路来降低小鼠机体炎症反应。溃疡性结肠炎的发病机制多认为与环境因素、遗传因素、免疫因素等有关,最近的研究热点多认为,溃疡性结肠炎与NF-κB信号通路密切相关。当机体受到外界刺激(如脂多糖、IL-1β、IL-6、TNF-α)时,NF-κB会与IκB分离,游离的NF-κB将进入细胞核,从而调控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的表达,从而活化机体NF-κB信号通路,迫使机体处于持续的活化状态,过多的炎性细胞因子会引起机体炎症,从而导致溃疡性结肠炎等炎症性疾病[17],这与我们的研究结果一致。3株益生菌联合疗法发挥作用的机制可能是因为,一方面,益生菌细胞壁可能存在某种活性成分,可能通过抑制NF-κB与IκB分离,从而阻止游离的NF-κB进入细胞核,无法调控细胞因子的表达,抑制机体NF-κB信号通路的持续活化,从而起到抗溃疡性结肠炎的功效[18],如图5,这也与本文中得到结论一致,人工模型UC小鼠结肠组织中NF-κB p65蛋白表达量较高,而IκB的表达较低,过多游离的NF-κB p65进入细胞核参与细胞因子的调控,从而引起机体的持续炎症反应,经过对UC小鼠两个疗程的益生菌混合治疗后,发现小鼠肠道的NF-κB p65蛋白表达量显著降低,而IκB的表达显著增高,说明3株益生菌可以抑制NF-κB p65与IκB的分离,从而,游离的NF-κB p65蛋白表达量显著降低;另一方面3株益生菌可能竞争UC小鼠致病菌的位点,从而平衡肠道菌群,来发挥抗溃疡性结肠炎的功效[19]。

图5　益生菌株对 NF-κB信号通路的影响Fig.5　Effects of probiotics strains on NF-κB signaling pathway

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Anti-colitis effect of probiotics mixture by the restrain of the NF-κB signaling pathway

XU Min,ZHAO Li,DU Jin-cheng,YU Shang-fu,DING Xiu-yun,HUO Gui-cheng*

(Northeast Agriculture University,Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Harbin 150030,China)

Based on the NF-Kappa B signaling pathway,the effect of probiotic mixture on the artificial ulcerative colitis mice was investigated,which provided a safe and reliable way for the treatment of human gastrointestinal Inflammation.Ulcerative colitis mice were provided with some probiotic mixture,and expression of crucial marker were determined by Western-blotting and ELISA tests. Results showed that the serum levels of IL-6,IL-1βand TNF-αwere significantly decreased(p<0.05),and that the protein expression of NF-κB was decreased and the protein expression of IκB was increased,in the probiotics group. Oral administration ofL.plantarum、L.acidophilusandL.helveticussuppressed NF-κB signaling pathway and had the anti-colitis effects. In detail,the probiotics inhibited the dissociation of NF-κB from IKB-α,blocking the translocation of NF-κB into the nucleus,down-regulated expression levels of the cytokine gene and suppressed the over-activation of the mice. Thus,probiotic mixture had good effect on the ulcerative colitis and had the potential to be applied into the clinical medicine.

Ulcerative colitis;Probiotic;NF-κB signaling pathway

2016-03-16

徐敏(1991-),女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail:15104595049@126.com。

霍贵成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物与生物技术，E-mail:gchuo058@126.com。

国家自然科学基金(31401512);国家863项目(2011AA100902)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0348-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.060