何巧丽，李柯翱，季志红，田树革

1新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐830011；2新疆奇康哈博维药有限公司；3新疆医科大学中心实验室

甜叶菊中总多酚及总多糖含量测定*

何巧丽1，李柯翱2，季志红2，田树革3△

1新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐830011；2新疆奇康哈博维药有限公司；3新疆医科大学中心实验室

目的:建立测定甜叶菊提取物中总多酚和总多糖含量的方法，并测定其含量。方法:分别以没食子酸和葡萄糖作为测定总多酚和总多糖含量的对照品，采用可见分光光度法测定甜叶菊提取物中总多酚和总多糖的含量。结果:测得甜叶菊提取物中总多酚总多糖含量分别为1.36 m g、1.73 m g。结论:该方法简单可行，重现性良好，测定结果准确、可信，可以作为甜叶菊提取物中总多酚和总多糖含量的测定方法。

甜叶菊提取物；总多酚；总多糖；含量测定

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni），别名甜菊、糖草、属菊科（Compositae），斯台维亚属，是一种多年生菊科草本植物。作为一种非糖、非营养型的甜味剂，甜叶菊符合现代健康饮食的理念，还具有清热、利尿、调节胃酸的功效。甜叶菊叶子的化学成分多种多样，主要成分是甜叶菊总糖苷，甜叶菊的根、茎、叶中含有甜叶菊糖甙，含量占10%左右。甜叶菊糖甙具有高甜度（为蔗糖的200～300倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）的特性［1］。此外，还富含黄酮类成分。截止目前，甜叶菊中的ent-贝壳杉烯型二萜类是研究最为深入的一类成分［2］。

预实验研究表明甜叶菊中还含有多糖和酚酸类成分。总糖是单糖、低聚糖、多糖等化合物的总和，其中多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗凝血、抗血栓、提高记忆力等作用［2-3］。植物多酚类化合物在自然界分布广泛，具有抗氧化、清除自由基、与金属离子发生络合、与蛋白质形成多种生理学活性等功能［4］，是有效的肿瘤化学预防剂［5］。此外，有些多酚类化合物本身具有抗肿瘤作用［6］。

本研究采用可见分光光度法测定甜叶菊提取物中总多酚和总多糖的含量，建立甜叶菊提取物中总多酚和总多糖含量测定方法，为甜叶菊资源的综合利用提供基础数据。

1　材料

1.1药材甜叶菊为采集于新疆阜康市（2013年9月，原料药材经新疆医科大学中医学院徐海燕老师鉴定为菊科多年生草本植物甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）的干燥叶片。

1.2试剂葡萄糖对照品（天津市天新精细化工开发中心）；没食子酸（批号：20130415，成都市科龙化工试剂厂）；钨酸钠、蒽酮、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、硫酸锂、双氧水、甲醇、乙醇、碳酸钠、硫酸等均为分析纯。实验用水为自制蒸馏水。

1.3仪器AK-100摇摆式中药粉碎机（温岭市奥力中药机械有限公司）；METTLER TOLEDO型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-200KDE型超声清洗器（昆山市超生仪器有限公司）；B-260水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；752紫外可见分光光度计（上海菁华）。

2　方法与结果

2.1福林酚试剂的制备［7］称取钨酸钠100.0g，钼酸钠25.0 g，用700 mL蒸馏水溶解于圆底烧瓶中，加入磷酸（85%）50 mL和100 mL浓盐酸充分混匀，小火加热回流12小时，放冷，再加入150 g硫酸锂，50 mL蒸馏水及0.2 mL双氧水，开口继续沸腾15分钟，使得双氧水完全挥发，冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL，过滤，于棕色瓶中避光储存。试液应呈亮黄色。如放置后变为绿色，可加双氧水0.2 mL，煮沸15分钟即可。

2.2没食子酸对照品储备液的制备精密称取2.2 mg没食子酸对照品，用蒸馏水溶解，定容至50 mL容量瓶中，得浓度为0.044 mg/mL的没食子酸对照品溶液。

2.3葡萄糖对照品储备液的制备精密称取0.100 0 g葡萄糖对照品，用蒸馏水溶解，定容至100 mL容量瓶中，得浓度为1 mg/mL的葡萄糖照品溶液。

2.4供试品溶液的制备采用正交实验方法优选甜叶菊中总多酚及总多糖的提取工艺。精密称取甜叶菊粉末（过三号筛）约1.0 g，加入25倍量水于90℃回流提取两次，1 h/次，合并滤液，蒸干成粉末。再精密称取粉末约5 mg，置于10 mL的容量瓶中定容至刻度线，充分摇匀，即得供试品溶液。

2.5测定波长的选择准确吸取没食子酸对照品溶液1.2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入福林试剂1 mL，摇匀，静置2分钟，再加入2 mL15%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容，混匀，75℃水浴10分钟，在400～800 nm波长范围内扫描没食子酸及样品的最大吸收波长，没食子酸对照品的扫描结果显示其最大吸收波长为760 2 nm，综合文献报道的最大吸收波长，确定在752 nm处测定甜叶菊提取物的总多酚含量。准确吸取葡萄糖对照品溶液0.5 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，再从中分别精密吸取1 mL于刻度试管中，加入硫酸蒽酮试液4 mL，摇匀，静置15分钟，沸水浴15分钟，冰水浴10分钟，在常温下于400～800 nm波长范围内扫描葡萄糖及样品的最大吸收波长，葡萄糖对照品的扫描结果显示其最大吸收波长为580 2 nm，综合文献报道的最大吸收波长，确定在588 nm处测定甜叶菊提取物的总多糖含量。

2.6标准曲线的制备和线性关系的考察

2.6.1总多酚对照品溶液的标准曲线准确吸取没食子酸对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL置于10 mL容量瓶中，加入福林试剂1 mL，摇匀，静置2分钟，再加入2 mL 15%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容，混匀，75℃水浴10分钟，在752 nm处测定其吸光度值。以没食子酸浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：A=61.364C+0.147 8（r2=0.996 8），结果表明，没食子酸在1.76～8.80 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6.2总多糖对照品溶液的标准曲线准确吸取葡萄糖对照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，再从中分别精密吸取1 mL于刻度试管中，加入硫酸蒽酮试液4 mL，摇匀，静置15分钟，沸水浴15分钟，冰水浴10分钟，于常温在588 nm处测定其吸光度。以葡萄糖浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：A=10.86C-0.147（r2=0.998 8），结果表明，葡萄糖在0.04～0.08 mg/mL范围内线性关系良好。

2.7精密度实验

2.7.1总多酚精密度实验分别精密吸取6份没食子酸对照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.1”项下方法操作，结果显示吸光度RSD值为1.17%，表明该方法精密度良好。

2.7.2总多糖精密度实验分别精密吸取6份葡萄糖对照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.2项”下方法操作，结果显示吸光度RSD值为1.54%，表明该方法精密度良好。

2.8稳定性考察

2.8.1总多酚稳定性考察分别精密吸取室温下放置0、5、10、15、20、30分钟的没食子酸对照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.1”项下方法操作，在752 nm处测定其吸光度值，结果表明吸光度RSD值为1.26%，表明其在30分钟内稳定性良好。

2.8.2总多糖稳定性考察分别精密吸取室温下放置0、1、2、3、6、12小时的葡萄糖对照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.2项”下方法操作，结果显示吸光度RSD值为1.46%，表明其在12小时内稳定性良好。

2.9加样回收率

2.9.1总多酚加样回收率采用加标回收法，精密量取已知量的甜叶菊干燥样品粉末5 mg，平行6份，按照“2.4”项下方法将其制成供试品溶液，从中吸取6份已知总多酚含量的水提取液0.2 mL，各加入对照品溶液0.5 mL，按照“2.6.1”项下方法测定其混合溶液的吸光度值，并计算其回收率，结果表明甜叶菊提取物中总多酚的平均回收率为98.53%，RSD为2.25%，表明该方法准确度良好，见表1。

表1　甜叶菊提取物总多酚回收率实验结果（n=6）

2.9.2总多糖加样回收率采用加标回收法，精密量取已知量的甜叶菊干燥样品粉末5 mg，平行6份，按照“2.4”项下方法将其制成供试品溶液，从中吸取6份已知多糖含量的水提取液0.1mL，取0.2mL葡萄糖对照品溶液，按照“2.6.2”项下方法测定混合溶液的吸光度值，并计算其回收率，结果表明甜叶菊提取物中总多糖的平均回收率为100.67%，RSD为1.98%，表明该方法准确度良好，见表2。

表2　甜叶菊提取物总多糖回收率实验结果（n=6）

3　含量的测定

甜叶菊提取物中总多酚、总多糖含量测定。按“2.4”项下方法，从10 mL水提取液中精密吸取0.5 mL稀释液，并按照“2.6.1”项下方法操作，测定其吸光度值。根据线性方程计算样品中总多酚的含量；按“2.4项”下的方法，从10 mL水提取液中精密吸取0.3 mL的稀释液，并按照“2.6.2”项下方法操作，测定其吸光度值。根据线性方程计算样品中总多糖的含量，见表3。

表3　甜叶菊提取物中总多酚和总多糖含量（n=3）

4　讨论

实验结果显示甜叶菊提取物中含有一定量的总多酚和总多糖，采用可见分光光度法测定甜叶菊提取物中总多酚和总多糖含量可行，结果准确，操作简便，重现性好，精密度高，可见分光光度法可以作为检测甜叶菊提取物中总多酚和总多糖的一种方法。

本研究采用2010版中国药典中蒽酮-硫酸法测定甜叶菊提取物中的总多糖，该法具有快速方便，价格低廉，且不需要特殊仪器等优点。

［1］马磊，石岩.甜叶菊的综合开发利用［J］.中国糖料，2009（1）:68-72.

［2］吴笳笛.多糖的作用及其研究进展［J］.沈阳师范大学学报：自然科学版，2008，26（2）:221-223.

［3］张峰，张继国，王丽华，等.黄精多糖对东莨菪碱致小鼠记忆获得障碍的改善作用［J］.现代中西医结合杂志，2007，16（36）:5410-5412.

［4］ZiX，Grasso A W，Kung H J，et al.A flavonoi dant ioxi dant，s i l y marin，i nhi bi t s act i vat i on of erbB1 signaling and induces cycl i n dependent Kinase i nhi bi t ors，G1arrest，and anti carcinogenic effects in human prostate carcinoma DU 145 cell s［J］.Cancer Res，1998，58（9）: 1920-1929.

［5］陈敏，刘晓芳，李秋娟，等.白黎芦醇对乳腺癌M CF-7细胞的抗增殖作用［J］.中国公共卫生，2004，20（11）: 1341-1342.

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Content Determination of Total Polysaccharide and Total Polyphenols of TianYeJu

HE Qiaoli1，LI Keao2，JI Zhihong2，TIAN Shuge3△

1 TCM College of Xinjiang Medical university，Urumqi，830011，China；2 Xinjiang QiKang HaBo Uygur Medicine Co.，LTD；3 Central Lab of Xinjiang Medical University

Objective:To establish the method of determining the contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu［Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl］，and determine their contents.Methods:The contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu were detected by visible spectrophotometric method，gallic acid and glucose were tanked as the control articles of determining total polyphenols and total polysaccharide.Results:The contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu were 1.36 mg and 1.73 mg respectively.Conclusion:The method，simple，feasible，reproducible，accurate and reliable，could be taken as the method of determining the contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu.

the extract of TianYeJu；total polyphenols；total polysaccharide；content determination

R284.1

A

1004-6852（2016）05-0034-03

2015-02-12

自治区科技支疆项目（编号2013911135）。

何巧丽（1990—），女，在读硕士研究生。研究方向：中药化学。

田树革（1969—），男，教授。研究方向：中药化学。