张亚武，权柯

1兰州大学第二医院胆胰外科，甘肃兰州730000；2甘肃中医药大学

芍药苷对HepG2肝癌细胞凋亡的诱导作用

张亚武1，权柯2

1兰州大学第二医院胆胰外科，甘肃兰州730000；2甘肃中医药大学

目的：探讨芍药苷（Paeoni florin）对H epG 2肝癌细胞凋亡的诱导作用，并考察其作用机制。方法：用不同浓度芍药苷（0.5，2 m g/m L）对HepG 2肝癌细胞进行培养，采用MTT法检测细胞活力，酶标法检测Caspase 3活性，western blot法检测N F-κB信号通路相关蛋白表达。结果：随着给药浓度的增加，芍药苷能逐渐降低H epG 2肝癌细胞活力，在48小时抑制率最高；并能提高Caspase 3活性，抑制细胞核内N F-κB p65磷酸化，IκBα磷酸化，从而促进细胞凋亡。结论：芍药苷可能通过N F-κB信号通路诱导H epG 2肝癌细胞凋亡，达到抗肿瘤效果。

HepG 2肝癌细胞；凋亡；NF-κB信号通路；磷酸化；芍药苷

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，目前其主要治疗手段为手术，但术后易复发，转移率较高。因此，寻求有效治疗肝癌，降低复发率的药物成为研究热点。

芍药苷（Paeonif1orin，PF）是从毛茛科植物芍药（Paeonia Lactiflora Pa11）中提取的有效单体成份，能抗各种肿瘤活性［1-4］。已有报道芍药苷可上调Bax，p53表达，下调Bc1-2表达，促进HepG2肝癌细胞凋亡［1］，但其具体机制尚不可知。并且芍药苷可通过抑制NF-κB信号通路，抑制胃癌细胞增殖［2-3］，本研究在此基础上探讨芍药苷是否通过抑制NF-κB信号通路来诱导HepG2肝癌细胞凋亡。

1　材料与方法

1.1细胞系与药物HepG2肝癌细胞购自美国标准生物品收藏中心（ATCC），细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中。芍药苷购自中国药品生物制品检定所。

1.2试剂与仪器四唑盐试剂（MTT）（sigma公司）；BCA法蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）；ECL超敏发光液（碧云天生物技术研究所）；小鼠p65抗体（碧云天生物技术研究所）；β-actin（碧云天生物技术研究所）；兔IκBα抗体（Epitmics公司）；兔抗pp65抗体（Epitmics公司）；Caspase 3分光光度法检测试剂盒（南京凯基生物技术有限公司）；胎牛血清（Gbico公司）；DMEM培养基（Gbico公司）；CO2培养箱（Thermo Scientific公司）；超净工作台（Thermo Scientific公司）；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪（瑞士TECAN集团公司）；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

1.3方法

1.3.1MTT实验将80%左右融合的HepG2肝癌细胞，消化，细胞浓度调整为4×103个/mL，接种，37℃5% CO2培养箱中培养24小时。加入含PF，终浓度为0.5、1、2mg/mL的DMEM培养基中，继续培养24、48、72小时，加MTT（5mg/mL）20μL，培养4小时后弃上清，加DMSO 150 μL，10分钟左右后570 nm处测定OD值。计算药物对细胞生长的抑制率。

1.3.2Caspase 3酶活性检测将80%左右融合的HepG2肝癌细胞，消化，细胞浓度调整为4×103个/mL，接种，37℃5%CO2培养箱中培养48小时。加入含PF，终浓度为0.5、1、2 mg/mL的DMEM培养基中，按照Caspase 3酶活性检测试剂盒说明书进行操作，收集细胞，裂解，加底物，显色，于405 nm处测定吸光度。

1.3.3w est ern bl ot收集细胞，加入RIPA裂解液，收获蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。跑SDS凝胶电泳，后湿法砖膜。孵一抗过夜，二抗1小时后，在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件对各抗体条带灰度值进行统计。

1.4统计学方法数据采用SPSS 17.0软件统计分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1芍药苷对H epG 2肝癌细胞增殖抑制作用随着给药浓度的增加，芍药苷对HepG2肝癌细胞抑制作用逐渐增强，在2 mg/mL时抑制率最大；随着24、48、72小时给药时间的增加，芍药苷对HepG2肝癌细胞抑制作用也逐渐增强，其中48、72小时作用强度一致，所以在后续实验中选取48小时作为给药浓度，见表1。

表1　芍药苷对H epG 2肝癌细胞增殖抑制作用（±s）

表1　芍药苷对H epG 2肝癌细胞增殖抑制作用（±s）

注：与前一剂量组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

组别剂量/（m g·m L-1）抑制率/% 24 h48 h72 h对照组00.1±0.023.0±0.33.1±0.5 0.53.5±0.8*14.5±2.1**14.3±2.4**芍药苷16.5±0.5*23.7±3.6**23.8±3.8**2 10.7±1.9**35.3±5.1**35.2±4.3**

2.2芍药苷对HepG 2肝癌细胞Caspase 3活性的影响芍药苷（0.5、1、2 mg/mL）能提高HepG2肝癌细胞Caspase 3活性，并呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1　芍药苷对HepG 2肝癌细胞Caspase 3活性的影响

2.3芍药苷对HepG 2肝癌细胞NF-κB通路的影响芍药苷能抑制HepG2肝癌细胞细胞核NF-κB p65蛋白磷酸化，并呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05），而对细胞核内p65表达无任何影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。因此继续探讨NF-κB p65上游蛋白的影响，结果发现芍药苷能抑制HepG2肝癌细胞IκBα蛋白磷酸化，并呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05），但对IκBα自身表达无任何影响，见图2。

图2　芍药苷对H epG 2肝癌细胞N F-κB通路的影响

3　结论

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其危害仅次于肺癌，目前其主要治疗手段为手术，但即使获得手术切除机会，其复发、转移率依然较高［5-9］。因此，寻求有效治疗肝癌，降低复发率的药物成为当务之急。而抗肿瘤药物包括化疗药物、激素、生物制剂都能引起肿瘤细胞发生调亡。凋亡对肿瘤的抑制起重要作用，并且抑制NF-κB活性促进细胞凋亡是治疗肿瘤的有效手段之一［10］。芍药苷可通过抑制NF-κB信号通路来抑制胃癌细胞增殖［2-3］，所以本研究拟尝试用不同浓度（0.5、1、2 mg/mL）芍药苷对HepG2肝癌细胞进行培养，结果表明随着给药浓度的增加，芍药苷可逐渐降低细胞活力，抑制肿瘤细胞的增殖，在48小时时抑制率达到最高点。

Caspase 3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，其被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式，可对多种蛋白底物进行降解，在细胞凋亡过程中起关键作用，被认为是整个凋亡级联反应的一个关键调节点［11］。Caspase 3在HepG2肝癌细胞中活性高于给药组［12-14］，在本研究中，与对照组比较，芍药苷（0.5、1、2 mg/mL）呈剂量依赖性抑制Caspase 3活性。

NF-κB是一类广泛存在于肿瘤细胞内的重要转录因子，是多信号转导途径的汇聚点，参与组织细胞的免疫调节，炎症反应，生长分化和凋亡等［15-16］。未受刺激时与IκB结合，当受到刺激时，IκB磷酸化，释放NF-κB，使之恢复转录活性并从细胞质转移到细胞核内，调节相关基因的表达。NF-κB在各种肿瘤细胞中均过表达［17］，朱开梅等［18］报道八角中莽草酸可通过抑制NF-κB p65活性，抑制人肝癌HepG2细胞增殖。本研究结果表明芍药苷能抑制HepG2肝癌细胞NF-κBp65，IκBα蛋白磷酸化，最终提高Caspase 3活性，诱导肿瘤细胞凋亡。

因此，芍药苷可能通过NF-κB信号通路，提高Caspase 3活性，促进HepG2肝癌细胞的凋亡。

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Apoptotic Induction Effects of Paeoniflorin on Hepatoma Carcinoma Cells

ZHANG Yawu1，QUAN Ke2
1 Biliary Pancreatic Surgery Department of Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730000，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore apoptotic induction effects of paeoniflorin on hepatoma carcinoma cells（HepG2），and to investigate its mechanism.Methods:HepG2 cells were cultivated with different concentrations of paeoniflorin（0.5，2 mg/mL），cell viability was detected by MTT method，Caspase 3 activity measured by enzyme linked immunosorbent assay and the expression of NF-κB signaling pathway related protein by western blot method. Results:As the concentrations of the drug increased，paeoniflorin could decrease the viability of HepG2 cells gradually，and the inhibition rate reached the highest within 48 hours；it increased Caspase 3 activity，inhibited the phosphorylation of NF-κB p65 and IκBα，thereby to promote cellular apoptosis.Conclusion:Paeoniflorin could obtain anti-tumor effects by inducing the apoptosis of HepG2 cells via NF-κB signaling pathway.

hepatoma carcinoma cells；apoptosis；NF-κB signaling pathway；phosphorylation；paeoniflorin

R735.7

A

1004-6852（2016）05-0023-03

2015-02-19

张亚武（1971—），男，硕士学位，副主任医师。研究方向：消化道肿瘤的诊治。