纪世琪，孙志伟，韩志兴，张海建， 程文龙， 赵玉千

(1.首都医科大学附属北京地坛医院泌尿外科，北京　100015；2.首都医科大学公共卫生学院，北京　100069)



·基础研究·

shRNA靶向抑制CD74基因对人肾透明细胞癌细胞786-O生物学行为的影响

纪世琪1，孙志伟2，韩志兴1，张海建1， 程文龙1， 赵玉千1

(1.首都医科大学附属北京地坛医院泌尿外科，北京100015；2.首都医科大学公共卫生学院，北京100069)

目的探讨抑制人CD74基因后对肾透明细胞癌786-O细胞生长和侵袭能力的影响。 方法通过慢病毒lentivirus-CD74转染肾透明细胞癌786-O细胞后，MTT法检测786-O细胞活力的变化，利用流式细胞学检测肿瘤细胞的凋亡变化情况，Transwell小室实验检测786-O细胞侵袭能力改变情况，采用Westernblot方法检测转染前后786-O细胞CD74及相关蛋白的变化情况。结果慢病毒转染786-O细胞后细胞中CD74蛋白水平表达明显低于对照组(P<0.05)，抑制CD74蛋白表达水平后786-O细胞生长明显受到抑制，细胞活力降低，凋亡增加，细胞侵袭能力降低，且Survivin、MMP-2、MM-9蛋白也随之下降，其与对照组结果对比差异具有统计学差异(P<0.05)。结论利用慢病毒转染技术抑制CD74的表达可以抑制肾透明细胞癌786-O细胞的增值和侵袭能力，CD74基因可能作为癌基因在肾透明细胞癌中起作用。

肾癌；肾透明细胞癌；CD74；增值；侵袭

CD74蛋白开始研究是作为一种Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histoeompatibility complex classⅡ, MHCⅡ)相关的Ⅱ型跨膜糖蛋白被发现的。CD74蛋白生理条件下主要表达于单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、胃肠道黏膜上皮细胞及活化B细胞等抗原递呈细胞 (antigenpresentingcell，APC)[1]。作为MHCⅡ类分子的蛋白伴侣，CD74蛋白于机体免疫过程的抗原递呈反应中发挥着重要作用，同时CD74还可作为MIF蛋白的高亲和受体，CD74蛋白参与调控由MIF触发的各种细胞信号通路，并对细胞与细胞、细胞与基质间(特别是肿瘤细胞)的黏附、转移过程均参与表达调控。最新有研究发现CD74蛋白除了能参与机体免疫反应外，在许多肿瘤中均有表达上调，如肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、肺小细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾细胞癌等，同时发现CD74蛋白在这些肿瘤的发生、肿瘤组织周围血管生成、肿瘤组织的发展和增加肿瘤侵袭能力及转移能力等众多方面均有重要的作用[2-5]。

肾细胞癌(renal cellcarcinoma, RCC)是泌尿外科最为常见的肿瘤之一，而肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)则占肾癌发病的绝大部分[6]，CD74在ccRCC中的表达及作用情况还罕有报道。本实验旨在探讨利用慢病毒转染沉默CD74基因对肾透明细胞癌786-O细胞生长和侵袭能力的影响，寻找CD74影响肾癌细胞生长的可能途径。

1　材料与方法

1.1细胞培养挑选肾透明细胞癌786-O细胞系培养，细胞购自北京大学第一医院泌尿外科研究所。肾透明细胞癌786-O细胞液氮中取出复苏，在5% CO237℃环境中，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中进行培养。对实验细胞分组：786-O细胞组(正常肿瘤细胞培养)、对照细胞组(加入慢病毒阴性液培养细胞)、CD74转染抑制细胞组(加入重组慢病毒培养细胞)。

1.2试剂上海吉凯基因公司提供CD74的shRNA重组慢病毒和阴性对照慢病毒，CD74 shRNA靶序列：ACACAGCTACAGCTTTCTT。小鼠抗人CD74多克隆抗体购自Sigma公司(美国)，兔抗人Survivn、MM-2、MM-9多克隆抗体均购自CST公司(美国)，兔抗人β-Actin抗体、碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体、AP标记的山羊抗兔IgG抗体均购自中杉金桥生物技术有限公司(北京)。

1.3细胞转染实验ccRCC 786-O细胞培养至5万～8万个，去血清同步化培养6 h，以1 μL∶10 000细胞数的比例，将病毒液加入细胞培养皿，继续细胞培养8 h，更换含10%胎牛血清的培养基，培养72 h，荧光电子显微镜下观察慢病毒转染786-O细胞效率。

1.4细胞活力实验(MTT实验)将786-O细胞组、对照细胞组和CD74转染抑制细胞组于0、12、24、48、72、96 h行MTT检测，细胞活力检测按照试剂盒中说明(南京凯基公司)进行操作。应用酶联免疫检测仪，测定各孔的不同时间光吸收值。

1.5流式细胞学实验将病毒转染培养72 h，转染成功的786-O细胞，行流式细胞凋亡检测，以胰酶消化液(不含EDTA)消化待检测细胞，用PBS冲洗液将待检测细胞悬液清洗两次，细胞悬液中加入500 μL Binding Buffer，摇匀后5 μL Annexin V-FITC加入悬液，混匀，悬液中再加入5 μL Propidium Iodide，悬液混匀，室温、避光环境下静置反应10 min，流式细胞学检测各组细胞凋亡情况。

1.6Tanswell小室实验50 mg/L Matrigel与稀释液按1∶5稀释，于上室聚碳酸酯膜上表面加入30 μL已稀释后的Matrigel (3.9 μg/μL)，静置于37 ℃环境中30 min，使Matrigel聚合形成凝胶。100 μL无血清RPMI-1640培养基加入每孔，于37 ℃静置30 min。消化3组实验细胞，离心弃去含10%胎牛血清培养液，用PBS冲洗液清洗、离心 2次，加入无血清的培养基，配置成新的细胞悬液，调整细胞密度5×105/mL，3组悬液各取100 μL加入Transwell小室，于下室加入10%血清的1640培养基500 μL，常规细胞培养48 h，擦去上室内的细胞及上层的基质胶，取下聚碳酸酯膜以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫进行聚碳酸酯膜细胞染色。Leica DC 300F正置显微镜下观察、细胞计数并拍照。

1.7Westernblot实验分别提取各组细胞蛋白，约60 μg，加入含β-巯基乙醇上样缓冲液，沸水浴5 min，于配置好的10% SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)上样，蛋白电泳分离。电泳完成后，将蛋白恒压电转至硝酸纤维素膜，以5%脱脂奶粉封闭30 min，加入CD74蛋白抗体、Survivn、MM-2、MM-9多克隆抗体(1∶1 000)，摇床过夜4 ℃，PBS冲洗液洗膜3次，加入AP标记的山羊抗小鼠/兔IgG二抗，孵育杂交，30 min室温摇床，取下纤维素膜滴加显色液，发光显色，以β-Actin的吸光度值为参照，扫描并分析各条带的吸光度值。

2　结　果

2.1病毒细胞转染荧光显微镜镜下观察，被病毒转染成功的细胞发出绿色荧光，显示病毒转染效率较高，证明利用慢病毒技术可以成功高效转染786-O细胞(图1)。

图1　慢病毒转染结果

慢病毒转染具有高效性，72 h成功转染的786-O细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。

2.2细胞活力实验与细胞凋亡实验病毒转染抑制CD74蛋白表达后，786-O细胞的生长增殖活性明显受到抑制，细胞凋亡数增加。转染细胞组在转染72 h抑制效率达最大 (47±4)%，较对照组细胞(100%)和786-O细胞组(100%)的增殖活力降低(53±2)%(P<0.01，图2)。细胞转染组72 h，凋亡细胞数(29±4)%最多，786-O组为(3.5±1)%，对照组细胞为(4.2±2)%(P<0.05)。

图2　细胞活力MTT检测结果

2.3Transwell小室实验(侵袭实验)小室薄膜细胞染色结果显示，在慢病毒抑制CD74蛋白表达后，肾透明细胞癌786-O细胞穿过基质胶细胞数减少，肿瘤细胞侵袭能力明显下降(图3)，48 h细胞培养后，786-O组穿过基质胶的细胞数为121.4±2.1，对照组穿过基质胶的细胞数为116.8±3.2，转染组穿过基质胶的细胞数为60.9±3.3(P<0.05)。

图3　小室实验结果(×200)

在光镜下观察结晶紫染色后786-O组和转染组细胞穿过基质膜的细胞数，转染组抑制CD74表达后细胞侵袭能力降低，细胞数明显减少。

2.4Westernblot蛋白检测各组中均有CD74蛋白的表达，对照组中CD74蛋白表达明显，而细胞转染组中CD74蛋白表达均明显受抑，随CD74蛋白抑制后Survivin、MMP-2、MM-9蛋白也随之下降，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4Westernblot蛋白印记实验结果

条带分别显示CD74、Survivin、MMP-2、MMP-9和β-Actin蛋白的表达情况，转染组抑制CD74表达后，Survivin、MMP-2、MMP-9也随之减。

3　 讨　论

RCC作为泌尿外科最为常见的肿瘤，肿瘤起源于肾小管上皮细胞，其中ccRCC是肾细胞癌最常见的发病类型，对早期肾细胞癌患者行之有效的手段为肾癌根治术和肾部分切除术，已得到泌尿外科医师的广泛认可，苏拉菲尼和苏尼替尼等靶向药物的治疗也在临床上取得了一定的成效，但对于晚期肾细胞癌患者，特别是存在肿瘤转移的患者，生存率依然较低，当前也缺乏行之有效的治疗手段[6-7]。随着近年来，流行病学、分子遗传学、生物化学、分子生物学、基因诊断学等学科的迅速发展，参与肾细胞癌发生发展的因素被大量发现，泌尿外科已将肾细胞癌分子生物学作为热点领域进行研究[7]。

最近的大量研究显示，在肿瘤的发生发展过程中炎症因子扮演着重要的角色，许多肿瘤的发生都来源于慢性炎症的持续性刺激，进一步促进了肿瘤细胞在机体的存活、增殖和转移。CD74蛋白作为与Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histoeompatibility complex classⅡ, MHCⅡ)相关的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD74蛋白一般主要表达于APC细胞，近年来国内外研究发现，CD74蛋白高表达于许多恶性肿瘤组织，CD74蛋白所具有的其他生物学作用正逐渐被研究认识[1,3]。机体内源性抗原多种多样，肿瘤细胞抗原亦可作为潜在的内源性抗原分子，CD74蛋白具有能够阻断MHC-II类分子与内源性免疫抗原肽结合的能力，所以当CD74蛋白大量表达以后，可以降低肿瘤细胞的免疫源性，从而大大增加了肿瘤细胞逃离免疫监视的机会，使肿瘤细胞得以存活下来。除此以外，MIF基因对p53基因有负性调控，当MIF与CD74结合后，可以降低p53的磷酸化水平，减少细胞凋亡，使细胞周期继续进行[4]。还有研究表明，在非小细胞肺癌组织中CD74与MIF存在共表达的情况，MIF/CD74复合物可以增加CXC趋化因子等促进血管新生的因子分泌，增加肿瘤及周围组织的血管密度，由此推测CD74蛋白可能还可以参与调控血管生成相关的因子，来影响肿瘤的发生、发展过程[1-2]。

本研究发现CD74在肾透明细胞癌786-O细胞中表达，通过慢病毒转染技术，抑制了CD74蛋白在肾透明癌细胞786-O中的表达，786-O细胞的生长和增殖能力受到了明显抑制，786-O细胞凋亡增加，并呈现出一定的时间依赖性，72h达到高峰。Transwell实验发现抑制CD74表达后肿瘤细胞穿过基底膜数量减少，细胞侵袭能力降低，随CD74蛋白被抑制后Survivin、MMP-2、MM-9蛋白表达也随之出现下降。细胞的生长和凋亡信号失控是恶性肿瘤发生的重要标志，Survivin(存活素、生存素)属于凋亡抑制蛋白家族(IAP)的成员，于大多数正常终末分化组织中无表达或较少表达，而在许多机体肿瘤组织中均有大量表达；Survivin不仅具有抑制细胞凋亡的作用，同时在细胞的有丝分裂环节、细胞的周期调控环节和促进肿瘤细胞及周围组织血管的生成环节中均起到重要作用[8]。既往大量研究显示：RCC的分化、肿瘤的侵袭及转移与肾细胞癌细胞具有诱导分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的能力息息相关, MMP-2和MMP-9在MMPs家族中属于Ⅳ型胶原酶，作为最为重要的两种水解蛋白，参与降解Ⅳ型胶原，而Ⅳ型胶原是细胞外基质(extraeeUular matrix，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)的主要成分，在肿瘤细胞发生侵袭和转移过程中具有重要作用[9]。以上提示我们CD74可能作为癌基因，通过调控这些凋亡及侵袭的信号通路，对肾透明细胞癌786-O细胞的生长和侵袭能力产生作用[10]，但其影响肿瘤细胞的确切信号通路依然有待研究。

肾细胞癌发生的病因及影响因素至今还无法确定，我们通过本次研究CD74基因在肾透明细胞癌细胞786-O中的表达及相关作用，提示我们CD74对于肾透明细胞癌的发生、发展具有重要意义，可以进一步深入研究，为揭示肾细胞癌的发生提供新的研究思路。

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(编辑何宏灵)

Inhibition of CD74 gene by shRNA affects the biological behaviors of human clear cell renal cell carcinoma cell line 786-O

JI Shi-qi1, SUN Zhi-wei2, HAN Zhi-xing1, ZHANG Hai-jian1, CHENG Wen-long1, ZHAO Yu-qian1

(1.Department of Urology, Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100015;2.Public Health Institute, Capital Medical University,Beijing 100069, China)

ObjectiveTo explore the effect and mechanism of CD74 modulating growth and invasion on human clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) cell line 786-O. MethodsThe 786-O cells were transfected with lentivirus-CD74. The vitality of 786-O cells was detected with MTT assay. The apoptosis was detected with flow cytometry. The invasion was assessed with Transwell assay. The expression of CD74 was tested with Western blotting.ResultsAfter transfection, the expression of CD74 was decreased (P<0.05), the cell growth was significantly inhibited, apoptosis increased, invasion ability decreased, and the expression of Survivin, MMP-2 and MM-9 decreased (allP<0.05). ConclusionsKnocking down of CD74 induced decreased cell proliferation and invasion, which may play a role in the oncogenes of ccRCC.

renal cancer; clear cell renal cell carcinoma; CD74; proliferation; invasion

2016-02-01

2016-06-03

2013年首都医科大学基础临床科研合作课题(No.1300171706)

赵玉千，主任医师.E-mail：zhaoyuqian56@sina.com

纪世琪(1983-), 男(满族), 博士研究生, 副主任医师.研究方向:泌尿系肿瘤. E-mail: jishiqi09 @163. com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.09.017