庄雪峰, 林文雄, 林金国, 关　鑫, 李吉庆

(1.福建农林大学材料工程学院；2.福建农林大学作物科学学院，福建 福州 350002)



建柏心材6种试剂提取物的抑菌效果

庄雪峰1, 林文雄2, 林金国1, 关鑫1, 李吉庆1

(1.福建农林大学材料工程学院；2.福建农林大学作物科学学院，福建 福州 350002)

采用生长速率法研究建柏心材6种试剂(蒸馏水、甲醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯)提取物对彩绒革盖菌和密粘褶菌生长抑制的影响，以探究建柏心材的抗腐能力.结果表明：蒸馏水提取物对彩绒革盖菌无抑菌效果；丙酮提取物的EC50最低，为0.409 g·L-1，当含量为1.000 0 g·L-1时，其抑制率最高，达到64.61%，显示丙酮提取物对彩绒革盖菌的抑菌能力最强.除了蒸馏水外，5种试剂提取物都对密粘褶菌有抑菌效果，其中以甲醇提取物的EC50最低，为0.283 g·L-1，当含量为0.500 0 g·L-1时，其抑制率最高，达到64.03%，显示甲醇提取物对密粘褶菌的抑菌能力最强.此研究结果为建柏在生产加工过程中产生的剩余物的合理利用提供科学依据.

建柏; 木材腐朽菌; 提取物; 抑菌作用

各种抗菌活性成分存在于树木等自然界的各种植物的提取物中[1-3].而存在于植物提取物中的成百上千种化学物质已被鉴定出来[4].研究发现，大多数耐腐树种的心材耐腐能力很强，而树木的边材则容易被木材腐朽菌侵蚀[5-7].前人[8-11]对四十多种木材利用木材腐朽真菌进行抑菌试验的结果表明，各种树木的抗菌和防腐性能相差悬殊.通过对植物提取物化学物质的探究，很多抑菌物质被发现，如酯类、酚类、黄酮类和有机酸等[12-14].建柏(Fokieniahodginsii)是一种柏科的乔木，材质坚实、 抗腐性强[15]，主要分布在我国的南方地区，是国家二级濒危植物，一些具有抑菌效果的化学物质都能从多种柏科植物中提取出来[16].近些年来，国内外研究者已对多种植物提取物的耐腐和抑菌能力进行了研究.如李素英等[17]用甲醇和乙酸乙酯等试剂对桑和圆柏等4种树种的心材进行了提取，采用生长速率法测定各种提取物对彩绒革盖菌和密粘褶菌的抑菌活性，并对木材的防腐性能进行了研究.张玲[18]对银杏树木提取物的防腐性能进行了研究，其在试验中针对不同试剂分别采取了索式提取法和热回流提取法，并采用滤纸片法对抑菌效果展开了研究，发现银杏心材三氯甲烷提取物对白腐菌和褐腐菌都有抑菌作用.此外，前人[5-7,9-11,14,16,19]对龙柏叶、6种蒿属植物和5种松科植物的提取物进行了抑菌效果的研究，试验多采用滤纸片扩散法和生长速率法，且常利用金黄色葡萄球菌等细菌及青霉菌、彩绒革盖菌、密粘褶菌等真菌作为植物提取物抑菌试验的菌种，在培养基方面则多采用牛肉膏蛋白胨培养基.目前，关于建柏具有强耐腐性的原因并不大了解，为深入了解建柏心材的抑菌和耐腐机理，本试验参考前人的方法，使用麦芽糖琼脂培养基，采用生长速率法研究建柏心材提取物对白腐菌和褐腐菌抑菌能力的影响，旨在为建柏在生产加工过程中产生的边角料、锯屑和锯粉等剩余物的合理利用提供参考.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试树种建柏心材碎料和锯屑取自福建省南平市顺昌县林产品市场，风干后用粉碎机粉碎并过筛.筛选40～60目的木粉作为试验的原材料，置于冷冻室中密封保存.

1.1.2供试菌种白腐菌：彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)，其在国外多被称为云芝栓菌(Trametesversicolor)，由中国林业微生物菌种保藏管理中心供应；褐腐菌：密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)，由福建农林大学生命科学学院供应.

1.1.3试剂及其他材料蒸馏水自制；甲醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚和乙酸乙酯都为分析纯，由天津市富宇精细化工有限公司生产；马铃薯、琼脂和麦芽糖等购自市场.

1.1.4麦芽糖琼脂培养基的配制取削皮后的土豆200 g、15 g琼脂、20 g麦芽糖和1000 mL蒸馏水，加热溶解混合后过滤，稀释定容至1000 mL，平均装到6个150 mL锥形瓶中，随后高压灭菌(于121 ℃灭菌30 min).

1.2方法

1.2.1提取物的制备采用冷凝管进行热回流提取.分别将100 g建柏心材木粉装进圆底烧瓶中，用6种试剂分别提取两次.第1次按照原料与试剂为1∶7的比例提取5 h，随后取出过滤；第2次按照原料与试剂为1∶5的比例提取3 h.为了节约原料，尽可能将原料中的提取物都提取出来，倡导循环利用，第2次所用的原料即为第1次提取过滤完的剩料.由于第1次提取后原料中的提取物已不多，为了节省试剂，将第2次原料与试剂的比例设为1∶5，所加试剂少于第1次，且提取时间也相应缩短，为3 h.将两次的滤液混合，在旋转蒸发仪上进行减压蒸发，制得膏状物.将膏状物置冰箱(4 ℃)中待用.

1.2.2提取物抑菌活性的测定采用生长速率法[19]测定6种试剂提取的建柏心材提取物对彩绒革盖菌和密粘褶菌生长的抑制率.将两种木材腐朽菌放在麦芽糖琼脂培养基平板上分别培养7～10 d，再将灭菌后的培养基加热熔化，冷却到50 ℃左右，用移液枪分别量取供试样品到灭菌的盛有一定量培养基的培养皿中摇匀.由于蒸馏水提取物对彩绒革盖菌和密粘褶菌无抑菌作用，只对其他5种试剂的含量进行设置(表1、2)，同时分别设置空白对照(即培养皿中不加入试剂).在超净工作台上进行接菌操作，沿着菌落的外围，用打孔器制取菌丝块，直径为7.0 mm，用接种环移到上述6个培养皿的中央(每种试剂含药培养基都设置5个含量梯度，再加上空白对照的培养皿，则每种试剂含药培养基都要用到6个培养皿).此外，为避免试剂对两种真菌的抑菌作用，设置1组5个空白对照，分别加入1 mL各自的提取试剂到相应的培养皿中.在试验过程中发现微量的甲醇都会对两种真菌产生较强的抑菌作用，因此在移入菌丝块前要将培养基中的甲醇挥发掉.将培养皿放到恒温、恒湿的培养箱中，温度设置为28 ℃.若空白对照培养皿(即每组中不加入试剂的培养皿)中的菌丝约长到培养皿直径的三分之二时，就可以测量菌落的生长直径.试验重复3次.菌丝生长抑制率/%=(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100.

毒力EC50是指在一定时间内，一半的试验物出现某种伤害的毒物浓度，在本试验中指的是抑制50%菌体生长所对应的试剂含量，EC50越小，则试剂的抑菌能力越强.毒力EC50由抑制率与几率值换算，算出每个抑制率所对应的几率值.用对数值表示含量，用每种试剂含量的对数值(x)减掉几率值(y)，即得到毒力回归方程(y=bx+a)，并算出抑制菌丝生长的毒力EC50[20].

表1　彩绒革盖菌抑菌试验培养基中的试剂含量Table 1　Concentration of poison malt agar solid medium against C.versicolor　g·L-1

表2　密粘褶菌抑菌试验培养基中的试剂含量Table 2　Concentration of poison malt agar solid medium against G.trabeum　g·L-1

2　结果与分析

2.1建柏心材提取物的得率及膏状物质的颜色

表3　建柏心材提取物的得率及膏状物质的颜色Table 3　Yield and colour of extractives of F.hodginsii

表3显示，除蒸馏水外，5种试剂提取物的得率与试剂极性呈正相关，甲醇的得率最大，其次分别为丙酮、乙酸乙酯和三氯甲烷，非极性试剂石油醚提取物的得率最低.

2.2建柏心材提取物对两种木材腐朽菌的抑菌活性

从图1可见，除蒸馏水外，建柏心材5种试剂提取物对彩绒革盖菌都有一定的抑菌效果，抑菌活性随着试剂含量的增加而增大，与含量呈正相关，原因是试剂含量越大，培养基中的抗菌成分越多.当试剂含量为0.500 0 g·L-1时，丙酮、乙酸乙酯、甲醇、石油醚和三氯甲烷提取物对彩绒革盖菌的抑制率分别为48.49%、47.70%、42.13%、37.04%和35.91%，抑制率最高的是丙酮提取物；当试剂含量为1.000 0 g·L-1时，丙酮提取物的抑制率也最高，达到64.61%.

图1　建柏心材提取物对彩绒革盖菌的抑菌活性

从图2可见，除蒸馏水外，建柏心材5种试剂提取物都对密粘褶菌有抑菌效果，且5种试剂提取物的抑菌效果随着试剂含量的增加而增大.当试剂含量为0.500 0 g·L-1时，甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯和氯仿提取物对密粘褶菌的抑制率分别为64.03%、54.78%、47.98%、45.06%和34.84%，抑制率最高的是甲醇提取物；当试剂含量大于0.500 0 g·L-1时，石油醚提取物的抑制率稍好于甲醇提取物.

2.3建柏心材提取物对两种木材腐朽菌的毒力

从表4可见，除蒸馏水外，建柏心材5种试剂的含量与抑菌效果呈正相关，毒力回归方程的相关系数(R2)都大于0.9，随着提取物含量的增加，提取物对彩绒革盖菌的抑菌效果逐渐增强.5种试剂提取物对彩绒革盖菌的EC50为0.409～0.690 g·L-1.根据EC50的大小，显示5种试剂提取物对彩绒革盖菌抑菌能力的大小为：丙酮提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物，蒸馏水提取物基本无抑菌能力.可见，在木材防腐方面，建柏心材最适的试剂为丙酮.但与传统的木材防腐剂ACQ相比，丙酮提取物的EC50比ACQ[21]大很多.

图2　建柏心材提取物对密粘褶菌的抑菌活性

试剂毒力回归方程(y=bx+a)相关系数(R2)EC50/(g·L-1)ACQy=1.2290x+7.29310.96120.0138丙酮y=1.0640x+5.41270.97050.4094甲醇y=1.5558x+5.42870.94820.5302乙酸乙酯y=1.5381x+5.41080.97580.5407三氯甲烷y=1.2544x+5.21040.91700.6796石油醚y=2.0294x+5.32720.98550.6899蒸馏水 ---

1)EC50为3次重复试验的平均值；ACQ的数据引自文献[21].

从表5可见，除蒸馏水外，建柏心材5种试剂的含量与抑菌效果呈正相关，毒力回归方程的相关系数(R2)都大于0.9，EC50为0.283～0.856 g·L-1.根据EC50的大小，显示5种试剂提取物对密粘褶菌抑菌能力的大小为：甲醇提取物>石油醚提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物.可见，甲醇提取物对密粘褶菌的抑菌效果最好

对毒力回归方程y=bx+a进行分析可知，式中斜率b的大小表示真菌对药剂反应的灵敏度，b越大，灵敏度越高，即随着药剂含量的增加，抑制率明显增大，但当含量达到某个峰值时，抑制率的增大会逐渐放缓.表5显示：石油醚提取物毒力回归方程的b大于甲醇提取物，在含量达到1.000 0 g·L-1时，抑制率增幅明显且略超过甲醇提取物，此后增幅趋于平稳；而石油醚提取物的最低抑制含量为0.125 0 g·L-1，甲醇提取物则为0.062 5 g·L-1，再结合EC50的大小，可得出抑制密粘褶菌的最佳试剂提取物为甲醇提取物.这也可以解释图2中，当试剂含量大于0.500 0 g·L-1时，石油醚提取物的抑制率稍好于甲醇提取物的现象.但与ACQ的EC50[21]相比，甲醇提取物的抑菌效果明显较弱.

表5　建柏心材提取物对密粘褶菌的毒力1)Table 5　Toxicity of extractives from F.hodginsii on G.trabeum

1)EC50为3次重复试验的平均值；ACQ的数据引自文献[21].

3　结论与讨论

(1)除蒸馏水外，建柏心材5种试剂提取物对彩绒革盖菌的EC50为0.409～0.690 g·L-1，且抑菌效果与试剂含量呈正相关.其中，丙酮提取物的EC50最低，为0.409 g·L-1，表明其对彩绒革盖菌的毒力最大，当含量为2.000 0 g·L-1时，丙酮提取物的抑制率达到80%，但抑制率略小于石油醚提取物.在y=bx+a的毒力回归方程中，b的大小对于各试剂在不同含量下的抑制率有较大影响，且由于在某种程度上彩绒革盖菌的每次生长是不可控的，试验中略有误差在所难免.综合各方面考量，再根据EC50的大小，得出建柏心材5种试剂提取物对彩绒革盖菌抑菌能力的大小为：丙酮提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物.可见，对彩绒革盖菌抑菌能力最强的是丙酮提取物.

(2)除蒸馏水外，建柏心材5种试剂提取物对密粘褶菌的抑菌效果也不尽相同，且抑菌效果与试剂含量呈正相关.5种试剂提取物对密粘褶菌的EC50为0.283～0.856 g·L-1，以甲醇提取物的EC50最低，为0.283 g·L-1，表明其对密粘褶菌的毒力最大；而氯仿提取物的毒力最小，当含量为2.000 0 g·L-1时，甲醇提取物的抑制率大于96%；当含量大于0.500 0 g·L-1时，石油醚提取物的抑制率稍好于甲醇提取物.结合“结论与讨论”中(1)的分析结果，再根据EC50的大小，得出建柏心材5种试剂提取物对密粘褶菌抑菌能力的大小为：甲醇提取物>石油醚提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物.可见，对密粘褶菌抑菌能力最强的是甲醇提取物.

本试验结果探明了建柏心材提取物对彩绒革盖菌和密粘褶菌的抑菌效果，为建柏在生产加工过程中产生的剩余物的合理利用提供了科学依据.

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(责任编辑:施晓棠)

A comparative analysis of the antibacterial effect of six kinds of reagent extractives ofFokieniahodginsiiheartwood

ZHUANG Xuefeng1, LIN Wenxiong2, LIN Jinguo1, Guan Xin1, LI Jiqing1

(1.College of Material and Engineering; 2.College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To study the anti-corrosive capacity ofFokieniahodginsiiheartwood, six kinds of reagents were used to extractFokieniahodginsiiheartwood, and followed by inhibiting ability againstCoriolusversicolorandG.trabeumby growth rate method. Results showed that hot water extracts had no antibacterial effects onC.versicolor. Among them, acetone extracts had the lowestEC50at 0.409 g·L-1, and the highest bacteriostatic rate at 64.61% when its concentration was 1.000 0 g·L-1. Except for hot water extracts, all the five extractives demonstrated antibacterial effects againstG.trabeum. Among them, methanol extracts had the lowestEC50at 0.283 g·L-1, and when its concentration was 0.500 0 g·L-1, it showed the highest bacteriostatic rate at 64.03%. To summarize, acetone extracts fromF.hodginsiihad the best antibacterial effects againstC.versicolorand methanol extracts had the best antibacterial effects againstG.trabeum, which provided a sound theory basis for utilization ofF.hodginsiiresidues.

Fokieniahodginsii; wood-rotting fungi; extractive; inhibiting effect

2015-11-02

2015-12-13

国家农业成果转化项目(K1A14102A)；福建省科技计划项目星火计划重点项目(2013S0034、2014S0027、2015S0035)；福建省高校产学合作项目(2015H6001).

庄雪峰(1990-)，男，硕士研究生.研究方向：家具与木材科学.Email:1562655090@qq.com.通讯作者李吉庆(1970-)，男，副教授.研究方向：家具与木材科学.Email:nfuljq@163.com.

S781.42

A

1671-5470(2016)05-0576-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.05.016