张海悦，杨雪，李震，于浩

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

血红铆钉菇黄酮体外抗氧化活性的研究

张海悦，杨雪，李震，于浩

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

研究血红铆钉菇黄酮提取工艺及其体外抗氧化作用。在单因素基础上，采用响应面优化血红铆钉菇黄酮提取的最佳工艺条件。以VC为对照，对其清除1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、羟自由基（·OH）的能力进行探讨。结果表明最佳工艺条件为：乙醇体积分数83%、液料比15∶1（mL/g）、提取时间2.5h、提取温度85℃，在此条件下进行验证试验，血红铆钉菇黄酮的提取率可达6.72%。血红铆钉菇总黄酮清除DPPH自由基、·OH的IC50值分别为0.01、0.17 mg/mL，均高于VC。表明血红铆钉菇黄酮具有较强的体外抗氧化活性。

血红铆钉菇；黄酮；响应面；抗氧化作用

血红铆钉菇［Chroogomphus rutilus（Schaeff.）O.K. Mill.］，属担子菌亚门、牛肝菌目、铆钉菇科、铆钉菇属。分布于吉林、黑龙江、辽宁、河北、山西、云南、四川、西藏、广东、湖南等地区［1］，其菌肉肥厚，肉质细嫩，风味好，且营养丰富，含有蛋白质、糖类、脂肪、微量元素及人体必需的氨基酸［2］。目前对血红铆钉菇的研究多数集中在形态、分类和栽培和发酵方面［3-4］。国内外主要研究了血红铆钉菇多糖的提取工艺［5］、体外抗氧化活性［6］、提高免疫力［7］、抑菌活性［8］以及醇溶性色素［9］。关于血红铆钉菇的其他生物活性物质鲜有报道，具有广阔的开发利用前景，本文主要对血红铆钉菇总黄酮的提取工艺进行了优化及体外抗氧化活性进行了研究。

1材料与方法

1.1材料与试剂

血红铆钉菇：购买于吉林省延吉市，由东北师范大学生物系鉴定；无水乙醇、氢氧化钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、双氧水：北京化工厂；亚硝酸钠：莱阳化工实验室；硝酸铝：天津市光复精细化工研究所；磷酸氢二钾、铁氰化钾、三氯化铁：天津市光复科技发展有限公司；三氯乙酸：天津市致远化学试剂有限公司；邻菲罗啉：天津基准化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：东京化成工业株式会社；以上试剂均为分析纯。芦丁标准品：北京恒元启天化工技术研究院与北京世纪奥科生物科技有限公司联合研制。

1.2仪器与设备

SHHW21.600AⅡ三用恒温水箱：天津市泰斯特仪器有限公司；TG16GT高速台式离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；UV754可见光分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；FW135中草药粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥器：上海精宏实验设备有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机：北京博医康技术公司。

1.3方法

1.3.1血红铆钉菇总黄酮提取工艺流程

原料烘干→粉碎→脱脂→干燥→提取→抽滤→合并滤液→减压浓缩→冷冻干燥→总黄酮

1.3.2操作要点

1）烘干：将血红铆钉菇65℃烘干。

2）粉碎：将烘干后的血红铆钉菇粉粹过80目筛，备用。

3）脱脂：石油醚（沸点60℃～90℃）浸泡24 h。

4）提取：采用乙醇回流提取，乙醇体积分数83%、液料比15∶1（mL/g）、提取时间2.5 h、提取温度85℃，提取3次合并滤液。

5）减压浓缩：将滤液浓缩至无醇味，得到浸膏。

6）冷冻干燥：将总黄酮冷冻干燥24 h，得到总黄酮干粉。

1.3.3芦丁标准曲线的制备［10］

准确吸取105℃烘干至恒重的芦丁对照品2.5 mg，配制成浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液，分别吸取50、100、200、400、800 μL相当于（5、10、20、40、80 μg）标准溶液别置于10 mL具塞刻度的比色管中，各加入30%乙醇至5 mL，分别加入5%亚硝酸钠水溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min；加入10%硝酸铝水溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min再分别加入4%氢氧化钠水溶液4 mL，加入30%乙醇至10 mL，静置10 min，在最大吸收波长510 nm下，以芦丁浓度为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.001 1x-0.002 4，相关系数R2=0.999 4。

1.3.4血红铆钉菇总黄酮提取率的测定［11］

式中：m为试样的质量，g；m1为根据标准曲线中计算出被测液总黄酮含量，μg/mL；V1为待测液中分取体积，mL；V2为待测液总体积，mL。

1.3.5响应面优化试验

利用试验设计得到的数据采用多元二次回归方程，寻求最优工艺参数，通过响应面试验设计方法分析回归方程［12-13］。

在单因素试验结果的基础上，用Design-Expert软件以血红铆钉菇总黄酮提取率为指标，确定选用Box-Behnken试验设计的自变量有乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取温度，通过响应面对提取条件进行优化，响应面因素水平见表1。

表1　响应面因素及水平设计Table 1Factors and levels for response surface analysis

1.3.6验证试验

将得出的最佳提取工艺条件重复操作5次，验证其稳定性。

1.3.7血红铆钉菇总黄酮体外抗氧化活性研究

在验证试验的基础上，血红铆钉菇500 g提取总黄酮，用血红铆钉菇总黄酮干粉配置不同浓度的黄酮水溶液，进行体外抗氧化试验。

1）DPPH自由基清除试验［14］。

2）羟基自由基清除试验［15］。

1.4数据处理

每次试验设3个平行，取平均值，数据采用Excel软件和Design Expert 8.06软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1响应面优化试验

在单因素试验基础上，以血红铆钉菇总黄酮提取率为响应值，采用Box-Benhnken的中心组合试验设计，进一步进行四因素三水平的分析试验。Design-Expert试验方案及结果见表2。

表2　Design-Expert试验方案及结果Table 2Experimental design and results for response surface analysis

续表2Design-Expert试验方案及结果Continue table 2Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert软件进行回归分析，经排除不显著项后，得到如下回归方程：Y=5.95+0.13×A+0.37× B+0.73×C+0.059×D+0.025×A×B+0.040×A×C+0.022×A× D+0.2×B×C+0.050×B×D+0.010×C×D-0.56×A2-0.59×B2-0.21×C2-0.14×D2。

方差分析见表3。

表3　方差分析表Table 3Analysis varlance

续表3方差分析表Continue table 3Analysis varlance

对此回归模型进行分析，由表3可知，一次项D不显著，B、C对模型的影响极为显著，A对模型影响为显著，二次项A2、B2、C2极为显著，该模型的相关系数为R2=0.966 4，自变量与响应值之间的线性关系也很显著，可以用作理论上血红铆钉菇总黄酮类化合物提取试验的预测分析。均方值越大意味着该因素对提取率的影响越大。从表3可知，对响应值（提取率）影响因素的主次顺序为：C＞B＞A＞D，即提取时间＞液料比＞乙醇体积分数＞提取温度。通过对回归模型进行分析，可以得到曲面的最大点，求导方程解得A=83.48%，B= 15.88∶1（mL/g），C=2.5 h，D=85.28℃。在该条件下血红铆钉菇总黄酮理论提取率6.66%。

图1　因素交互作用对黄酮提取率的影响Fig.1The influence of factors interaction of flavonoids extraction yield

2.2验证试验

考虑到实际操作的各种条件，对血红铆钉菇总黄酮的最佳提取工艺条件进行修正：A=83%，B=15∶1（mL/g），C=2.5 h，D=85℃，在此条件下重复5次进行验证试验，验证试验结果见表4。血红铆钉菇总黄酮提取率可达到6.72%。

表4　最佳条件的验证试验Table 4The optimum condition of experiment

2.3血红铆钉菇总黄酮体外抗氧化活性研究

2.3.1DPPH自由基清除试验

VC和血红铆钉菇总黄酮对DPPH自由基的清除能力见图2。

图2　VC和血红铆钉菇总黄酮对DPPH自由基的清除能力Fig.2DPPH radicals scavenging capacity of VCand total flavonoids from Chroogomphis rutilus

如图2所示，血红铆钉菇总黄酮类对DPPH自由基有较高的清除率，随着血红铆钉菇总黄酮质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，呈现出正相关，血红铆钉菇总黄酮质量浓度在0.08 mg/mL，清除率能达到93.88%以上，但在同等条件下，VC的清除率是75.66%，其清除DPPH自由基的IC50值为0.01 mg/mL，由此可表明血红铆钉菇总黄酮具有较好的抗氧化性。

2.3.2羟基自由基清除试验

VC和血红铆钉菇总黄酮对羟基自由基的清除能力见图3。

图3　VC和血红铆钉菇总黄酮对羟基自由基的清除能力Fig.3Hydroxyl radicals scavenging capacity of VCand total flavonoids from Chroogomphis rutilus

由图3可以看出，随着样液质量浓度的增加，对·OH的清除率呈逐渐上升趋势，质量浓度在0.2mg/ mL以前增长速度较快，且质量浓度在＞0.1 mg/mL时，血红铆钉菇总黄酮对·OH的清除能力已经超过VC。可以看出血红铆钉菇总黄酮对·OH有较强的清除能力，在达到一定质量浓度以后要优于VC，其清除·OH的IC50值为0.17 mg/mL，表明其具有较好抗氧化能力。

3结论

响应面优化血红铆钉菇总黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数83%、液料比15∶1（mL/g）、提取时间2.5 h、提取温度85℃，在此条件下进行验证试验，血红铆钉菇总黄酮的提取率可达6.72%，各因素对提取率的影响主次顺序为：提取时间＞液料比＞乙醇体积分数＞提取温度。血红铆钉菇总黄酮体外抗氧化实验结果表明，清除能力在一定范围内随血红铆钉菇总黄酮质量浓度的升高而升高，均呈现出一定的量效关系，且均高于VC，其清除DPPH自由基、·OH的IC50值分别为0.01、0.17 mg/mL，由此可知，血红铆钉菇总黄酮具有较好的体外抗氧化能力。

［1］李贞卓.血红铆钉菇化学成分及其抗肿瘤活性的研究［D］.长春：吉林农业大学，2014：13

［2］孙海涛，邵信儒.长白山野生血红铆钉菇的开发利用现状与发展前景［J］.人参研究，2010，22（4）：23-24

［3］栾庆书.血红铆钉菇研究现状及开发利用［J］.食用菌，2002（2）：2-3

［4］陈青君，程继鸿，杜园园，等.北京地区大型真菌资源初步调查［J］.北京农学院学报，2006（2）：39-43

［5］Chenyu Wang，Jing Zhang，Fei Wang，et al.Extraction of crude polysaccharides from Gomphidius rutilus and their antioxidant activities in vitro［J］.Carbohydrate Polymers，2013，94（1）：479-486

［5］Yong-Xu Sun，Ji-Cheng Liu，John F Kennedy.Extraction optimization of antioxidant polysaccharides from the fruiting bodies of Chroogomphis rutilus（Schaeff.：Fr.）O.K.Miller by Box-Behnken statistical design［J］.Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：209-214

［6］Chanjuan Gao，Yanhua Wang，Chenyu Wang，et al.Antioxidant and immunological activity in vitro of polysaccharides from Gomphidius rutilus mycelium［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：2187-2192

［7］祝鹤鸣，吴艳玲，李雪，等.血红铆钉菇子实体对人肝星状细胞LX-2和人肝癌细胞Hep G2增殖的影响［J］.安徽农业科学，2013，41（15）：6651-6653

［8］李华，卫敏，姚新宇，等.血红铆钉菇醇溶性色素的提取和稳定性研究［J］.中国食品添加剂，2011（6）：125-129

［9］Weihua Xiao，Lujia Han，Bo Shi.Microwave-assisted extraction of flavonoids from Radix Astragali［J］.Separation and Purification Technology，2008，62（3）：614-618

［10］张海悦，王黎兵，郭新力，等.狭叶荨麻总总黄酮的测定［J］.食品科技，2007（12）：181-184

［11］Zuo-Fu Wei，Xi-Qing Wang，Xiao Peng，et al.Fast and green extraction and separation of main bioactive flavonoids from Radix Scutellariae［J］.Industrial Crops&Products，2014，63：175-181

［12］Zun-Lai Sheng，Peng-Fei Wan，Chun-Liu Dong，et al.Optimization of total flavonoids content extracted from Flos Populi using response surface methodology［J］.Industrial Crops&Products，2013，43：778-786

［14］Yanghe Luo，Xingren Li，Juan He，et al.Isolation，characterisation，and antioxidant activities of flavonoids from chufa（Eleocharis tuberosa）peels［J］.Food Chemistry，2014，164：30-35

［15］Sun Lijun，Zhang Jianbao，Lu Xiaoyun，et al.Evaluation to the antioxidant activity of total flavonoids extract from persimmon（Diospyros kaki L.）leaves.［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49（10）：2689-2696

Antioxidant Activity in vitro of Chroogomphis rutilus Flavonoids

ZHANG Hai-yue，YANG Xue，LI Zhen，YU Hao
（College of Chemical and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

The extraction and antioxidant activity in vitro of flavonoids from Chroogomphis rutilus was investigated.The extraction process was optimized using response surface methodology.The evaluation of antioxidant activity was carried out by DPPH radical and hydroxyl radical scavenging assays in comparison to VC.The optimumextractionconditionsweredeterminedas83%，15∶1（mL/g），2.5 h and 85℃forethanolconcentration，solvent-to-solid ratio，extraction time and temperature，respectively.The experimentally observed on extraction efficiency of flavonoids under the optimized conditions was 6.72%.In DPPH radical and hydroxyl radical scavenging assays，the IC50of the flavonoids from Chroogomphis rutilus were 0.01，0.17 mg/mL，were higher than that of VC.These results showed that flavonoids of Chroogomphis rutilus had strong antioxidant activity in vitro.

Chroogomphisrutilus；flavonoids；responsesurface；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.026

2015-11-09

张海悦（1967—），女（汉），教授，博士，研究方向：天然产物提取及功能食品研发。