杜鹃，吴津蓉，吴忠红

（1.新疆农业职业技术学院食品工程学院，新疆昌吉831100；2.新疆农业科学院农产品贮藏加工所，新疆乌鲁木齐830091）

不同产地昆仑雪菊抗氧化活性比较研究

杜鹃1，吴津蓉1，吴忠红2

（1.新疆农业职业技术学院食品工程学院，新疆昌吉831100；2.新疆农业科学院农产品贮藏加工所，新疆乌鲁木齐830091）

采用化学发光法比较不同产地昆仑雪菊水提物的体外抗氧化活性，结果表明，3种不同产地、海拔的雪菊水提物均能有效地清除O2-·、HO·和H2O2，只是对不同的自由基清除效果不同。和田高原雪菊对O2-·、HO·的清除效果都是好的，达坂城平原雪菊对H2O2的清除效果最好，田高高原雪菊和喀什高原雪菊对HO·的清除效果都优于维生素C，不同产地、海拔雪菊中黄酮含量与O2-·、HO·的清除率之间相关性良好。

不同产地；雪菊；抗氧化性

雪菊［1-2］是生长海拔3200米以上的雪山之隅及喀喇昆仑山脉的野生蛇目菊，所以又称昆仑雪菊、天山雪菊，其花期极短，产量稀少，是目前新疆惟一与雪莲齐名，具有独特功效的稀有高寒植物。长期以来，昆仑雪菊被新疆和田当地居民当花茶饮用，有燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒的功效。近年来，雪菊以其卓越的降血压、降血脂功能，成为茶界新宠，身价暴增，目前在新疆和田、喀什、达坂城开始产业化种植。雪菊中含有丰富的黄酮类化合物［3-4］，研究表明，黄酮类化合物也是一类天然强抗氧化剂，其中很多黄酮类化合物的抗氧化活性甚至大于维生素E。化学发光法具有灵敏度高、检测限低、线性范围宽等特点，常用于抗氧化活性的测定，而且仪器操作快捷简便，便于自动化分析［5］。本试验分别以生长在不同产地、不同海拔高度的3种昆仑雪菊为研究对象，采用化学发光法比较不同产地昆仑雪菊水提物的体外抗氧化活性，以期为雪菊花茶的深入研究及新疆雪菊资源的综合开发利用提供基础。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

材料：采自3个不同地点的昆仑雪菊样品分别为新疆和田皮山县克里阳高原雪菊（生长海拔3 200 m左右）、新疆喀什高原雪菊（生长海拔2 000 m左右）、新疆达坂城平原雪菊（生长海拔1 000 m左右）。50℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，储藏备用。

鲁米诺（色谱纯）：Sigma公司；芦丁标准品（色谱纯）：上海金穗生物有限公司；乙醇、铁氰化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、没食子酸、邻苯三酚、硫酸亚铁、抗坏血酸均为分析纯；检测用水为重蒸水。

MPI-A型多参数化学发光分析测试系统：西安瑞迈分析仪器有限公司；FA2004电子天平：上海仪器天平厂；722型可见分光光度计：上海光谱仪器分析有限公司；KS-300EⅡ型超声波清洗机：宁波海曙科生超声设备有限公司；Edw ards Pirani 1001冷冻干燥器（U. K.）、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；粉碎机：浙江省瑞安市春海药材器械厂；RE-52旋转蒸发仪：上海青浦沪西仪器厂。

1.2方法

1.2.1雪菊供试样品溶液的制备

采用超声波提取法［6-7］，将3种雪菊样品粉碎，过60目筛，分别称取干燥的昆仑雪菊粉各5 g，加95%乙醇50 mL，于超声波清洗机中提取10 min，趁热减压抽滤，用80%乙醇定容至100 mL，摇匀后再稀释5倍即得样品溶液。

1.2.2雪菊水提物化学成分的测定

1.2.2.1雪菊总黄酮含量的测定

精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品105.8 mg，置100mL容量瓶中，用少量甲醇加热溶解，冷却后甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.058 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别精密吸取上述芦丁标准液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于25 mL的比色管中，加入1.5%AlCl38 mL和醋酸-醋酸钠的缓冲液（pH 5.5）4 mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5 h。以不加芦丁为空白，在415 nm波长下测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，以显色液中芦丁的浓度为横坐标，用最小二乘法进行回归，线性方程为A= 0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 4。结果表明，芦丁标准品溶液在浓度为15.3 μg/mL～59.75 μg/mL范围内浓度与吸光度的线性关系良好。采用AlCl3分光光度比色法［8-10］。取1.0 mL样品溶液于10 mL容量瓶，以不加样品的溶液做空白，以上述的条件测定吸光度，参照标准曲线计算浓度，平行测定3次，取平均值。

1.2.2.2雪菊提取物中的总酚测定

采用Folin酚法［11］测定雪菊总酚含量，没食子酸为标准品，760 nm处测定样品的吸光度值，以样品浓度为横坐标x，吸光度值为纵坐标y，绘制标准曲线，线性回归方程为：y=15.49x+0.000 1，R=0.999。

图1　AlCl3法芦丁标准曲线Fig.1AlCl3method of rutin standard curve

1.2.3化学发光法检测雪菊样品的抗氧化性

1.2.3.1雪菊提取物对超氧化阴离子（O2-·）清除测定

邻苯三酚一鲁米诺化学发光法［12］测定雪菊提取物对超氧阴离子O2-·的清除能力。将3种不同产地的雪菊样品分别配制成不同的浓度梯度（5、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL）的溶液，用不同浓度的抗坏血酸溶液为阳性对照，以水为空白。在反应池中加入0.2 mmol/L的鲁米诺溶液4、0.5mL样品（或空白）溶液和10mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，快速混匀，迅速置于发光仪测定室中，启动反应，测定180 s，每3 s的发光强度为I，用蒸馏水作空白，测其I0，计算样品液对O2-·的清除率（%）。以清除率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘出曲线，根据拟合方程计算清除率50%时的浓度IC50，即半抑制浓度，IC50值越大，样品清除超氧阴离子O2-·自由基的能力越弱。

1.2.3.2雪菊提取物对羟基自由基（HO·）的清除测定

Fe2+一双氧水一鲁米诺化学发光法［13］测定雪菊样品对羟基自由基HO·的清除能力。将3种不同产地的昆仑雪菊水提物分别配制成不同的浓度梯度，用不同浓度的抗坏血酸溶液为阳性对照，以蒸馏水为空白。在反应池中加入0.2 mmol/L鲁米诺溶液4 mL，样品（或空白）溶液0.5 mL，0.5 mmol/L Fe2+-EDTA0.2 mL，0.6%的双氧水溶液0.2 mL，快速混匀，迅速置于发光仪测定室中，启动反应，连续测定180 s，每隔3 s记录发光强度，至出现峰值，记录发光强度I，用蒸馏水作空白记录I0，以清除率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制曲线，计算IC50值。

1.2.3.3雪菊提取物对双氧水H2O2的清除测定

双氧水一鲁米诺-碳酸缓冲液体系测定雪菊样品对双氧水的清除能力。将3种不同产地的雪菊花水提物配分别配制成不同的浓度梯度，阳性对照为不同浓度的抗坏血酸溶液，以水为空白。在反应池中加入样品（或空白）溶液0.5 mL，0.4 mmol/L鲁米诺溶液和pH9.0的0.08 mol/L NaCO3-NaHCO3缓冲混合溶液，迅速混匀，立即置于发光仪测定室中，启动反应，连续测定180 s，每隔3 s记录发光强度，至出现峰值，记录发光强度I，用蒸馏水作空白记录I0，以清除率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制曲线，计算IC50值。

1.2.4数据统计分析

试验测试条件为：高压600 V，测试波长范围为200 nm～700 nm，采集速度0.1 ms，测试温度30℃，曲线的积分面积为相对发光强度，采用Origin 7.0软件进行数据统计，计算清除率用如下公式：

式中：I0表示不加样品时的空白发光强度，cd；I表示加入雪菊提取物样品时的发光强度，cd。

2结果与分析

2.1化学发光法检测雪菊样品的抗氧化性

2.1.1雪菊提取物对超氧化阴离子（O2-·）清除测定

邻苯三酚在碱性条件下自氧化可以产生超氧阴离子，鲁米诺是发光剂，超氧阴离子能激发鲁米诺，使鲁米诺由激发态返回基态产生化学发光。加入黄酮样品后，黄酮类结构中含有酚羟基，能提供活泼氢，可阻断自由基反应，抑制其化学发光。不同产地的雪菊水提物对O2-·的清除效果可见图2。

图2　雪菊提取物对超氧化阴离子（O2-·）清除能力比较Fig.2Comparison of the removal ability of the superoxide anion（·）in the snow chrysanthemum

3种雪菊黄酮化合物对O2-·均有清除作用，且随其雪菊提取物质量浓度的增大，清除效果逐渐增大，3种雪菊黄酮化合物清除率变化趋势相似，清除效果基本相当，在浓度范围0.125 mg/mL～0.5 mg/mL时，喀什高原雪菊黄酮提取物O2-·清除效果最好，在浓度范围1 mg/mL～5 mg/mL时，和田高原雪菊黄酮提取物O2-·清除效果最好。

2.1.2雪菊提取物对羟基自由基（HO·）的清除测定

硫酸亚铁一鲁米诺一双氧水化学发光体系中，Fe2+还原H2O2生成羟基自由基HO·，鲁米诺作为发光剂可以与HO·反应，产生化学发光，其发光强度与HO·在一定强度范围内呈线性关系，但黄酮和多酚类物质可将Fe2+氧化为Fe3+，阻断了该体系的反应，抑制化学发光。不同产地的雪菊水提物对HO·的清除效果可见图3。

图3雪菊提取物对羟基自由基（HO·）清除能力比较Fig.3Comparison of scavenging capacity of hydroxyl radical（HO·）with snow chrysanthemum

图3显示，浓度为0.125 mg/mL～1 mg/mL范围内，3种雪菊提取物对羟自由基的清除作用均有明显增强，清除作用和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞达坂城平原雪菊，其中当浓度为1 mg/mL时，和田高原雪菊的清除率可以高达81.35%。但是当浓度达到1 mg/mL之后，随浓度升高，3种雪菊对羟自由基清除率较为稳定，变化不大。

2.1.3雪菊提取物对双氧水H2O2的清除测定

H2O2在有氧和碱性条件下能氧化鲁米诺，可产生化学发光，发光强度的降低可以反映抗氧化物对过氧化物产生的抑制能力。不同产地的雪菊黄酮提取物对H2O2的清除效果如图4。

图4　雪菊黄酮提取物对H2O2除能力比较Fig.4Comparison of H2O2scavenging ability of extracts of snow chrysanthemum

3种雪菊黄酮提取物对H2O2的清除效果均随其质量浓度的增大而增大的趋势，呈良好的线性关系。浓度为0～0.15 mg/mL范围内，随浓度增加，清除率快速增大，当浓度大于0.5 mg/mL时，清除率随浓度增加而增速变缓，3种雪菊对H2O2的清除效果为：达坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊。

2.2雪菊提取物的抗氧化性与总酚、总黄酮含量的相关性分析

计算不同品种玫瑰花提取物对3种自由基清除率达50%时的样品浓度IC50及提取物中总酚、总黄酮的含量，结果如表1所示。

表1　不同产地的雪菊提取物的IC50及其总酚、总黄酮含量Table 1 IC50and total phenol and total flavonoids content of the extracts from different habitats of the chrysanthemum

3种雪菊对O2-·的清除效果依次为：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞达坂城平原雪菊，对HO·的清除效果依次为：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞达坂城平原雪菊，对H2O2的清除效果依次为：达坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊，可见不同产地、海拔的雪菊水提物对不同的自由基清除效果不同，与抗氧化物质维生素C相比，3种雪菊对O2-·和H2O2的清除效果均不如维生素C，但喀什高原雪菊和和田高原雪菊对HO·的清除效果优于维生素C，清除能力很强。

对雪菊提取物清除3种自由基的IC50与总酚、总黄酮含量做相关性分析，总黄酮含量与清除O2-·和HO·的IC50之间、总酚含量与清除H2O2的IC50之间呈负相关，即总黄酮含量对O2-·和HO·的清除能力呈正相关性，总酚含量对清除H2O2能力呈正相关性。多酚和黄酮类成分在3种雪菊水提物抗氧化活性中都能起作用，但是黄酮和多酚含量对清除不同自由基的效果有差异，其中总黄酮含量与O2-·和HO·的清除率之间相关性良好。有资料报导，多酚和黄酮类物质的抗氧化能力与其母核上“-OH”基团数目有关，母核上“-OH”基团数目越多，提供氢质子能力越强，抗氧化能力越强。当“-OH”基团数相同，且所在位置也相同，但C环结构不同，抗氧化能力也不同。Velioglu［14］等比较了28种植物材料的抗氧化活性与酚类物质含量的相关性，结果表明两者没有明显相关性。研究还认为除黄酮以外的其它物质，在抗氧化方面也起一定作用。新疆不同海拔地区生长的3种不同品种的雪菊，其黄酮和多酚的含量不同，同时雪菊水提物中还存在维生素C、绿原酸类等其他活性成分，同时具有清除自由基的能力，可见雪菊的抗氧化活性是多物质抗氧化活性的集合。同时，在对雪菊进行开发利用时，可有针对性的选择某方面抗氧化能力有优势的不同产地雪菊为原料，开发多种具有功能活性，抗氧化能力强的特色雪菊产品。本研究为雪菊的深加工，及在食品、保健品、医药中的应用奠定研究基础。

3结论

不同产地、海拔的雪菊水提物对不同的自由基清除效果不同，喀什高原雪菊和和田高原雪菊对HO·的清除效果优于维生素C，3种雪菊对O2-·的清除效果依次为：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞达坂城平原雪菊，对HO·的清除效果依次为：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞达坂城平原雪菊，对H2O2的清除效果依次为：达坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊，总酚含量与清除H2O2的能力有一定相关性，总黄酮含量与O2-·和HO·的清除率之间相关性较好。

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Comparative Study on Antioxidant Activity of the Different Habitats of Kunlun Snow Chrysanthemum

DU Juan1，WU Jin-rong1，WU Zhong-hong2
（1.Institute of Science Food，Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Research Institute of Agricultural Products Storage and Processing，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，Xinjiang，China）

The antioxidant capacity of three kinds different origin Kunlun snow Chrysanthemum was investigated by chemiluminescence.Scavenging abilities in vitro on O2-·，HO·and H2O2were determined by three chemiluminescence systems.The results showed that the chrysanthemum extracts had good scavenging activity on O2-·，HO·and H2O2，but different samples had diferent antioxidative activity and it was related to its components.Hetian Plateau snow chrysanthemum on O2-·，HO·scavenging effect was good，the best removal effect of plain of Dabancheng chrysanthemum on H2O2，scavenging effect of Hetian high plateau and Kashi Plateau snow chrysanthemum on HO·were better than that of vitamin C.In different places，at an altitude of snow chrysanthemum between flavonoids and O2-·，HO·clearance rate，good correlation.

differentareas；snowchrysanthemum；antioxidantcapacity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.004

2015-11-10

新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（No.XJEDU2013S52）

杜鹃（1978—），女（汉），副教授，硕士，从事食品加工教学及研究工作。