徐坚，顾艳红

（仙居县农产品检测中心，浙江台州317300）



检测分析

QuEChERS样品前处理-高效液相色谱法测定饲料中5种磺胺类药物

徐坚，顾艳红

（仙居县农产品检测中心，浙江台州317300）

本实验建立了QuEChERS样品前处理-高效液相色谱法测定饲料中5种磺胺类药物的方法。饲料样品中5种磺胺类药物经乙腈提取，用PSA、C18和无水硫酸钠分散固相萃取方法净化，氮气吹干复溶后，用高效液相色谱-紫外检测器测定。在10～500 μg/L的线性范围内，5种磺胺类药物线性相关系数（r2）均大于0.9990；检测限和定量限分别为0.05 mg/kg和0.1 mg/kg。在0.1～10 mg/kg添加浓度范围内，猪、鸡配合饲料中磺胺类药物平均回收率为76.0%～101%，批内相对标准偏差（RSD）为2.1%～10.1%。该方法条件易于控制，结果准确、重现性好，适用于饲料中5种磺胺类药物的测定。

磺胺类药物；饲料；QuEChERS；高效液相色谱法

磺胺类药物（SA2）是具有对氨基苯磺酰胺结构的药物总称，是常用的广谱抗菌药，因其具有抗菌谱广、高效、低毒和价格低廉等特点，在动物养殖中被广泛使用，其中一个重要的给药途径就是通过添加到饲料中使用。经常食用有磺胺类药物残留的动物源性食品，可引起磺胺类药物在人体内的逐渐累积，其危害性主要表现为细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌作用以及激素样作用等（李俊锁等，2002）。为了从源头控制动物性产品中磺胺类药物的残留，有必要对饲料中磺胺类药物的检测方法进行深入研究。目前，饲料及动物源性产品中磺胺类药物的检测方法多采用液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，而前处理以固相萃取法为主，过程较为繁琐，检测成本高（丑亚琴等，2013；朱莉萍等，2011；刘佳佳等，2011）。近年来，QuEChERS检测技术以其快速、简易、廉价、有效、稳定、安全等特点在农药残留、兽药残留、霉菌毒素检测领域得到了广泛应用，但在饲料中磺胺类药物的检测方面鲜见文献报道。本实验采用QuEChERS样品前处理-高效液相色谱法测定了饲料中5种磺胺类药物的含量，与传统固相萃取方法相比，大大节省了检测成本，简化了操作步骤，检测结果准确可靠。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂Agilent 1260高效液相色谱仪，配UV检测器；XS-205电子天平（Mettler公司）；SL502 N电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；3k30型冷冻离心机（Sigma公司）；BüCHI B-490旋转蒸发仪；20通道固相萃取装置（Waters公司）；MS2 minishaker涡旋混匀器（IKA公司）。C18、PSA、GCB均为QuEChERS专用材料，美国Agilent公司；乙腈、甲醇、乙酸为色谱纯，Merck公司；实验用水为milli-Q超纯水；磷酸、正丙醇、氯化钠、无水硫酸钠等为分析纯。磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺喹恶啉（SQ）和磺胺甲恶唑（SMZ）标准品，均购自SIGMA公司，含量均不少于99%。

标准储备液的配制（500 μg/mL）：分别准确称取磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和磺胺甲恶唑50.0 mg（精确至0.01 mg），置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，于4℃避光保存。

混合标准工作液（5 μg/mL）：分别精密量取5种磺胺类药物标准储备液1.00 mL，置同一100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即浓度为5 μg/mL的标准工作液，于4℃避光保存。

1.2样品前处理称取（5±0.05）g试样于50 mL离心管中，加入10 mL水，涡旋振荡1 min；加入25 mL乙腈，涡旋振荡1 min；加入5 g无水硫酸钠和2 g氯化钠，中速振荡提取10 min；于8000 r/min离心5 min，放置30 min；取上层乙腈提取液10 mL，置15 mL离心管中，加入C18150 mg、PSA 100 mg和无水硫酸钠900 mg，涡旋1 min，于8000 r/min离心5 min，倾出上清液至另一15 mL离心管中，40℃下氮气吹干；准确加入1.0 mL流动相，涡旋混匀1 min溶解残余物，过膜后上机测定。

1.3分析条件色谱柱：Waters symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流动相：乙腈-甲醇-2%乙酸溶液为（2∶2∶9，V/V/V），流速：1 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：50 μL。

1.4测定方法取适量相应浓度的标准液和试样溶液注入液相色谱仪，作单点或多点校准，以色谱峰面积进行定量。标准工作液及试样中磺胺类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样液测定过程中要参插注入标准工作液，以便准确定量。

2　结果与分析

2.1标准曲线及回收率取1.1中混合标准工作液，加流动相分别稀释制成10、20、50、100、200、500 μg/L的系列标准溶液，按设定的色谱条件进行仪器分析，以标准溶液浓度为X轴，峰面积为Y轴绘制标准工作曲线。结果表明，各种化合物的质量浓度为10～500 μg/L时线性良好，相关系数均大于0.9990。

2.2检测限和定量限以猪、鸡配合饲料样品为基质，分别添加浓度为0.02、0.05、0.1、0.2 mg/kg的磺胺类药物混合标准工作液，考察方法的检测限和定量限。经回收率实验，当饲料中添加磺胺类药物为0.05 mg/kg时，信噪比（S/N）均大于3；当饲料中添加磺胺类药物为0.1 mg/kg时，信噪比（S/N）均大于10。因此，本方法的检测限为0.05 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg。考虑到磺胺类药物是允许使用的兽药，以上结果完全能满足实际样品检测的需要。

2.3准确度和精密度取猪、鸡配合饲料样品进行加标回收率实验，系统考察方法的准确度和精密度。分别进行0.1、0.2、10 mg/kg添加浓度的回收率实验，每批次同一浓度做5个平行，每个浓度重复3次，分别计算批内、批间相对标准偏差，回收率实验结果见表1。

表1　不同饲料中5种磺胺类药物的添加回收率和精密度

从回收率结果可以看出，猪、鸡配合饲料样品为0.1～10 mg/kg添加浓度时，平均回收率为76.0%～101%，批内相对标准偏差（RSD）为2.1%～10.1%，可见本方法能满足猪、鸡配合饲料中磺胺类药物测定的需要。图1为添加浓度为0.2 mg/kg时，磺胺类药物标准溶液、猪空白饲料溶液和猪阳性添加饲料溶液的高效液相色谱图。

2.4实际样品检测采用建立的检测方法对市场随机抽检的124份猪、鸡配合饲料样品进行了检测，结果发现一份磺胺二甲嘧啶阳性样品，其浓度为（8.32±0.58）mg/kg（n=3）。同时采用GB/T 19542-2007对该样品进行了检测，测定结果为（8.57±0.66）mg/kg（n=3），两种检测方法结果一致。

图1　标准溶液（A）、猪空白饲料样品溶液（B）和猪阳性添加饲料样品溶液（C）高效液相色谱图

3　讨论

3.1检测条件的优化与选择

3.1.1检测条件的确定目前，国内外文献报道液相色谱法测定磺胺类药物的方法中，检测器包括紫外检测器和荧光检测器两种。采用荧光检测器进行检测虽然灵敏度较高，但是需要进行衍生化处理，操作步骤繁琐。磺胺类药物作为允许使用的兽药，为了满足临床使用的需要，其添加浓度往往比较高，紫外检测器在兽药和饲料含量测定方面更为常用，波长通常为270 nm。本实验采用紫外检测器进行检测，确定在270 nm波长的条件下进行检测。

3.1.2液相色谱分离条件的确定由于磺胺类药物含有氨基和苯磺酰胺结构，属于中等极性化合物，可采用传统C18柱作为分析柱进行分离，同时考虑在流动相中添加酸来改变色谱行为。本研究对Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm）柱、Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm）柱、Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等三种规格的色谱柱进行了比较，结果表明分离结果均较为满意。在流动相选择上，比较了磷酸溶液-乙腈、磷酸溶液-甲醇和乙腈-甲醇-乙酸溶液体系的色谱保留性能和灵敏度，结果发现乙腈-甲醇-乙酸溶液流动相体系磺胺类药物峰型最好、灵敏度最高，且大大缩短了分离时间。通过进一步优化乙酸溶液浓度和流动相配比，使磺胺类药物获得最佳峰型和保留时间，最终确定流动相为乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（2∶2∶9，V/V/V），流速为1.0 mL/min。

3.2样品前处理方法的优化磺胺类药物在甲醇、乙腈中具有较好的溶解性，同时考虑到饲料中蛋白质、脂肪含量高、样品基质复杂等特点，本实验采用乙腈作为提取剂，蛋白沉淀效果较为理想，提取时加入硫酸钠和氯化钠，在盐析作用下达到更好的除去杂质的效果。提取完成后，结合QuEChERS方法对提取液进行了净化。通过加标回收实验发现，石墨化炭黑（GCB）对磺胺类药物吸附能力很强，净化后回收率都偏低，而乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18和Na2SO4不仅对杂质有一定的吸附能力，而且对磺胺类药物的回收率影响小，优化使用量后达到了较好的效果。

3.3干扰实验考察在本研究色谱条件下，其他类似药物对磺胺类药物分析方法的干扰。以目前养殖环节常用兽药，如诺氟沙星、恩拉霉素、替米考星、阿莫西林为代表，进行干扰实验，采用磺胺类药物色谱条件进行检测，结果在该色谱条件下以上化合物均未出现色谱峰。

4　结论

本实验建立了QuEChERS样品前处理-高效液相色谱法测定饲料中5种磺胺类药物含量的分析方法。该方法采用QuEChERS技术对样品前处理条件进行系统优化，建立了快速、简易、廉价、有效、稳定、安全的前处理技术，并系统考察了液相色谱检测条件，大大提升了检测效率。在本实验的色谱条件下，被测药物与杂质得到了较好的分离，出峰时间合适。实验结果表明，该方法条件易于控制，结果准确、加标回收率稳定、重现性好，能够满足日常检测的要求，适用于饲料中磺胺类药物的测定。

［1］丑亚琴，唐巍，卢艳芬，等.高效液相色谱法同时测定水产品中四种磺胺类药物残留前处理条件的优化［J］.水产养殖，2013，1：25～31.

［2］李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析［M］.上海：上海科技出版社，2002. 228～232.

［3］刘佳佳，佘永新，刘洪斌，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中24种磺胺类药物残留.分析试验室，2011，30：9～13.

［4］朱莉萍，朱涛，武娜，等.高效液相色谱法测定猪肉中磺胺类药物［J］.肉类研究，2011，10：29～31.

A QuEChERS sample pretreatment coupled with high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of 5 sulfonamides in feed was optimized and validated.Samples were extracted by acetonitrile，and a QuEChERS purifing method with PSA，C18and Na2SO4was followed.Finally，the extraction was evaporated（40℃）and residue was dissolved in mobile phase.A waters symmetry C18colmun（250 mm×4.6 mm，5 μm）was employed for separation.As the results showed，the calibration curves were linear between 10 μg/L and 500 μg/L for sulfonamides（r2＞0.9990），and the limit of detection（LOD）was 0.05 mg/kg，and the limit of quantitation（LOQ）was 0.1 mg/kg.Recoveries of sulfonamides in swine and poultry feed were from 76.0%to 101%，when its additive concentrations were 0.1 mg/kg to 10 mg/kg，the relative standard deviation（RSD）for within-run assays were 2.1%～10.1%.It was concluded that this method was simple，sensitive and reliable for determination of sulfonamides in feed.

sulfonamides；feed；QuEChERS；HPLC

S816.17

A

1004-3314（2016）04-0039-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160410