汪祥燕，徐海燕，辛国芹，汪孟娟，董佩佩，赵影，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）



添加剂

γ-氨基丁酸产生菌的分离及发酵条件优化

汪祥燕*，徐海燕，辛国芹，汪孟娟，董佩佩，赵影，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

γ-氨基丁酸（GABA）是哺乳动物体内的一种抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能。利用酸菜、酸奶等食品进行乳酸菌的分离，通过纸层析法筛选得到1株产GABA量较高的菌株Y-3，经16SrDNA鉴定该菌株为短乳杆菌。单因素试验和正交试验确定的菌株Y-3最佳发酵条件为：葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸钠1.0%、丁二酸钠0.5%，初始pH为6.0，接种量6%，37℃静置培养48 h，GABA产量达12 g/L以上，比优化前产量提高了近5倍。

γ-氨基丁酸；分离；短乳杆菌；发酵

γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白氨基酸，属强神经抑制性氨基酸，具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的作用（Li等，2010）。应用于畜牧生产中能有效地提高动物抗应激能力和抗缺氧能力，改善动物生产性能和动物产品品质（谭良溪等，2012；吴俊锋和李吕木，2011）。通过减少动物的无意识运动以减少能量消耗，达到促生长的目的（吴凡和谭青松，2015；徐秋良等，2009）。GABA广泛存在于植物、动物、微生物中，合成制备方法主要有化学合成、植物富集和微生物发酵3种（Dhakal等，2012）。目前GABA的生产主要采用发酵法，而安全性高的乳酸菌可以利用体内的谷氨酸脱羧酶，将L-谷氨酸钠经α-脱羧后产生GABA，开发前景广阔。陆小雪等（2009）从泡菜和酸奶中分离出3株产GABA的乳酸菌，分别为乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种和唾液链球菌嗜热亚种，其发酵液中GABA含量分别达到3.680、3.341、2.700 g/L。蒋冬花等（2007）分离出相对高产GABA的植物乳杆菌，在最佳发酵条件下发酵液中GABA含量可达4 g/L。本试验从泡菜、酸奶等食品中分离高产GABA菌株，对其进行分子生物学鉴定，并优化菌株的发酵条件，为微生物发酵富集GABA的研究及相关产品的开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料泡菜、酸菜及各品牌的酸奶（伊利、蒙牛、亚奥特）等。

1.2培养基

1.2.1分离培养基胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、吐温-80 1 g/L、K2HPO42 g/L、醋酸钠5 g/L、柠檬酸二胺2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、pH 6.5～6.8，37℃培养48 h。

1.2.2种子培养基K2HPO42 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，无水乙酸钠5 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L。

1.2.3TYG发酵培养基胰蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，丁二酸钠5 g/L，L-谷氨酸钠10 g/L，pH 6.6～6.8。

1.3试验方法

1.3.1乳酸菌的分离分别取泡菜汁、酸菜汁及伊利、蒙牛、亚奥特酸奶各1 mL，接种于50 mL分离培养基中富集培养3 d，取富集培养液各1 mL，分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5浓度，将所有样品稀释液各取0.3 mL，倒入已灭菌的平皿中，然后倒入冷却至50℃左右的分离培养基混匀，凝固后置30℃培养箱中培养3 d，挑取带有溶钙圈的菌落，接种于MRS斜面培养基。

1.3.2乳酸菌的筛选将初筛得到的菌株转接于液体MRS种子培养基中，37℃静置培养12～15 h，然后以2%的接种量接入到含1%L-谷氨酸钠的TYG发酵培养基中，37℃静置培养24 h。将发酵液离心后进行检测分析。

1.3.3分析方法

1.3.3.1γ-氨基丁酸含量的测定GABA含量的测定采用纸层析-比色法。（1）展开：采用新华3号滤纸，每个样品点样4 μL，在室温下用不饱和法展开，展开剂用（苯酚∶水=4∶1）上行法展开；（2）定量：配制0.5%的GABA标准品，点样4 μL；菌株发酵液经离心后，取上清液点样4 μL，放入层析缸中展开；（3）显色：展开结束后自然晾干，用0.5%的茚三酮无水乙醇溶液喷淋，在65℃显色30 min；（4）比色测定：剪下GABA显色条带，用5 mL硫酸铜乙醇溶液（0.1%硫酸铜溶液∶75%乙醇=2∶38）浸泡30 min，然后测定520 nm波长下的吸光值（A）。根据标准品的A值和样品的A值即可计算出样品的GABA含量。

1.3.3.2菌株生长量的测定发酵培养过程中，在一定时间取培养液，以空白培养基作对照，于600 nm波长下测定吸光值（OD600）。

1.3.3.3pH的测定采用PHS-3C型精密pH计测定。

1.3.4发酵条件优化采用单因素试验和正交试验优化发酵条件。

1.3.5菌株的鉴定

1.3.5.116SrDNA扩增与序列分析目的菌株接种于新鲜的种子培养基中培养12 h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：1492r 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'27f 5'-AGAGTTG ATCCTGGCTCAG-3'；PCR反应体系（50 μL）为：Mixture 25 μL（含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司），上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超纯水21 μL。PCR扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

1.3.5.2系统发育分析登录GenBank（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov），利用Blast对菌株16SrDNA测序结果进行检索，并下载相关属种的16SrDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA5.2等软件进行同源性分析，并构建系统进化树。

2　结果与分析

2.1菌株筛选样品经处理后，利用乳酸菌选择培养基从各分离源中共分离纯化出113株乳酸菌，并编号保存。采用纸层析-比色法初筛，得到8株能够利用L-谷氨酸钠转化生成γ-氨基丁酸的菌株。

由表1可知，不同菌株产γ-氨基丁酸的能力有一定差别，仅2株菌的GABA产量高于1 g/L，其中Y-3在未经培养优化的条件下，可产生GABA 2.21 g/L。将Y-3菌株传接10代，分别测定Y-3菌株1～10代发酵后GABA产量，发现其GABA产量稳定，为（2.36±0.22）g/L，后续对菌株Y-3进行发酵条件优化。

表1　菌株筛选结果

2.2菌株Y-3发酵条件的优化

2.2.1接种量对发酵生产γ-氨基丁酸的影响由图1看出，接种量对Y-3菌株发酵生产GABA有较大的影响。接种量为2%～4%时，GABA产量在2.20 g/L左右；接种量增大至6%后，GABA产量明显提高，达4.46 g/L，提高2倍；接种量大于6%后，GABA产量降低，反而不利于菌株生产GA-BA。所以，菌株Y-3最优接种量确定为6%。

图1　接种量对Y-3菌株GABA产量的影响

2.2.2pH对发酵生产γ-氨基丁酸的影响将发酵培养基起始pH分别调为4.0、5.0、6.0和自然pH（6.70左右），研究发酵培养基起始pH对Y-3菌株生长、pH及GABA产量的影响，结果见图2。随着发酵培养基起始pH增大，Y-3菌株的菌体量和发酵液pH逐渐增大。发酵培养基起始pH为4.0时，发酵结束时菌体密度仅有1.084；而在起始pH为6.0时，发酵结束时菌体密度为2.109，两者相比，菌体密度增大了1倍。随着发酵培养基起始pH升高，GABA产量为先升高后降低，在pH=6.0时达最大，为3.10 g/L。在pH=6.0时菌体密度也较大，菌体量大代表有更多菌体参与GABA生产，因而GABA产量才会提高。虽然自然pH时（6.70左右）菌体生长量大于pH为6.0时，但是此时的发酵液pH较低，降低了谷氨酸脱羧酶的活性，GABA产量反而没有pH=6.0时高。综合分析，发酵培养基起始pH确定为6.0。

图2　发酵培养基起始pH对Y-3菌株生长、pH及GABA产量的影响

2.2.3发酵时间对发酵生产γ-氨基丁酸的影响发酵时间对于菌株Y-3和PS-9生产GABA有很大的影响，结果见图3。随着发酵时间延长，菌株Y-3的菌体密度逐渐增大，24 h达到最大，为2.109，之后处于基本稳定状态。发酵液pH在 24 h时最低，仅为2.94，然后升高，之后处于基本稳定。分析原因可能是：24 h前菌株增殖速度快，处于菌体积累阶段，菌株会迅速消耗葡萄糖，将其分解为小分子酸，使得发酵液pH降低，之后菌株Y-3会利用H+，在谷氨酸脱羧酶作用下将L-谷氨酸钠转化为GABA，又提高了发酵液的pH。且在一定范围内，GABA产量是随着发酵时间延长逐渐增大的，在48 h时达到最大，为3.57 g/L。此后，GABA产量有下降但不明显。从培养周期和成本等工业扩大生产因素考虑，培养时间不宜过长，确定菌株Y-3最佳发酵时间为48 h。

图3　发酵时间对Y-3菌株生长、pH及GABA产量的影响

2.3菌株Y-3发酵培养基的优化

2.3.1碳源对发酵生产γ-氨基丁酸的影响以TYG发酵培养基为基础，分别选取葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉及丁二酸钠为唯一碳源，添加量为10 g/L，发酵培养48 h后检测发酵液的GABA含量，结果见图4。结果显示，对于菌株Y-3，葡萄糖作为发酵培养基的碳源最为适合，麦芽糖、可溶性淀粉和丁二酸钠次之，蔗糖最差。葡萄糖作为可快速利用的碳源为菌株Y-3的生长和GABA生产提供能量来源，故以其作碳源，无论是菌株生长，还是GABA产量都优于其他碳源。

图4　碳源对Y-3菌株生长和GABA产量的影响

2.3.2氮源对发酵生产γ-氨基丁酸的影响以TYG发酵培养基为基础，分别选取胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵及硝酸钠为唯一氮源，添加量为10 g/L，发酵培养48 h检测发酵液的GABA含量。由图5可知，对于菌株Y-3，有机氮效果比无机氮效果好。硫酸铵、硝酸钠两种无机氮源发酵效果最差，纸层析图上基本看不出条带。酵母膏作为单一氮源发酵效果最好，GABA最高为5.95 g/L，其次是牛肉膏、蛋白胨和胰蛋白胨，玉米浆的效果较差。酵母膏中含有多种成分，相对于其他氮源，酵母膏的营养成分可能更有利于乳酸菌的生长，且其可能含有刺激谷氨酸脱羧酶活性的因子，因此GABA产量较高。

图5　氮源对Y-3菌株生长和GABA产量的影响

进一步，以TYG发酵培养基为基础，在以酵母膏作氮源的基础上分别复合蛋白胨、牛肉膏和胰蛋白胨为复合氮源，发酵培养48 h，以纸层析-比色法测定上清中GABA含量。由图6可知，对于菌株Y-3，以酵母膏和胰蛋白胨复合时发酵效果最好，GABA的产量达6.26 g/L，比酵母膏作唯一氮源时产量提高5%。所以，菌株发酵产GABA试验选择酵母膏复合胰蛋白胨作氮源。

图6　复合氮源对Y-3菌株生长和GABA产量的影响

2.3.3正交试验设计优化发酵培养基以葡萄糖为碳源，酵母膏和胰蛋白胨为复合氮源，添加L-谷氨酸钠，进行L9（34）正交试验设计。正交试验设计及结果分析见表2。

表2　L9（34）正交试验设计及结果分析

由表2可知，葡萄糖添加量对于GABA的产量影响最大。各成分对GABA产量的影响顺序为：葡萄糖＞胰蛋白胨＞酵母膏＞L-谷氨酸钠，极差分析的最优组合为A3B2C3D1。试验中最优组合为A3B1C3D2，GABA产量为12.67 g/L。由于最佳的培养基组成在试验中没有进行，所以根据正交试验给出的最佳培养基成分进行发酵，产量与7号试验相比没有明显提高。考虑成本等因素，确定菌株Y-3发酵配方为：葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸钠1.0%、丁二酸钠0.5%，pH 6.0。

2.4发酵液处理及冻干粉γ-氨基丁酸含量测定按照优化结果发酵培养菌株Y-3，在发酵结束后将发酵液冻干处理，计算100 mL发酵液的冻干粉比例，并以纸层析-比色法测定冻干粉中GABA的含量。结果显示，100 mL发酵液冻干后可得到3.72 g冻干粉，冻干粉中GABA含量为4.6%左右。

2.5菌株Y-3的鉴定

2.5.1菌落及菌体形态该菌株在分离培养基上培养24 h，其菌落形态扁平，白色不透明，边缘光滑，表面湿润，显微镜下观察菌体为短杆状，大多成对出现，革兰氏染色阳性。

2.5.216SrDNA序列和系统发育分析该菌株的PCR产物电泳图见图7，条带在1000～2000 bp处，约为1500 bp，与预期结果一致。

图7　菌株Y-3扩增产物琼脂凝胶电泳图

将菌株Y-3的16SrDNA序列在NCBI中进行BLAST比对分析，结果显示菌株Y-3与Lactobacillus brevis的序列同源性达到100%。鉴定该菌株属于短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。

从Genebank中调取并下载与菌株Y-3同源性较高的该属内其他相关菌株的16S rDNA，利用MEGA5.2软件的Neighboring-joining方法，构建系统进化树（图8）。

图8　菌株Y-3与相关菌株的系统进化关系

3　小结

从泡菜、酸菜及不同品牌酸奶等分离源中分离纯化得到113株乳酸菌，并以TYG培养基为基础发酵，筛选到8株能产GABA的菌株。通过单因素试验和正交试验对培养基和发酵条件进行优化，确定菌株Y-3最佳培养基组合和发酵条件为：葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸钠1.0%、丁二酸钠0.5%，初始pH为6.0，接种量6%，37℃静置培养48 h，此时发酵液中GABA含量达12 g/L以上，比优化前产量增加了近5倍。对发酵液进行冻干处理，Y-3菌株100 mL发酵液冻干后可得4 g左右冻干粉，冻干粉中GABA含量为4.6%左右。通过16S rDNA鉴定，菌株Y-3为一株短乳杆菌。

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γ-amino butyric acid（GABA）as a putative inhibitory in the vertebrate nervous system，has many important physiological functions.Using filter paper chromatography method，a lacto-bacteria Y-3 highly yielding GABA was isolated from different foods such as pickled vegetable and yoghourt.Y-3 was identified as Lactobacillus brevis by its cultural characteristics，morphological characteristics and 16S rDNA sequence.The optimal fermentation medium composition by single factor and orthogonal test showed as follows：glucose 1.5%，yeast extract 0.5%，tryptone 1.5%，L-sodium glutamate 1.0%，sodium succinate 0.5%.The better fermentation conditions were as follows：initial pH 6.0，inoculation amount 6%，temperature 37℃，fermentation 48 h.Using this optimization conditions，the GABA yield was over 12 g/L，which increased nearly 5 times than that before optimization.

γ-amino butyric acid；isolation；Lactobacillus brevis；fermentation

S816.7

A

1004-3314（2016）04-0027-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160407