邓元荣，李泳宁，黄晓敏，徐驯宇

(1.福建卫生职业技术学院，福州　350101；2.福建省立医院胸外科，福建医科大学省立临床医学院，福州　350001)



大气细颗粒物吸入动物模型建立及适用性评价

邓元荣1，李泳宁1，黄晓敏1，徐驯宇2*

(1.福建卫生职业技术学院，福州350101；2.福建省立医院胸外科，福建医科大学省立临床医学院，福州350001)

目的 建立大气细颗粒物(PM2.5)气溶胶慢性吸入致机体损伤的动物模型。方法 制备PM2.5气溶胶连续吸入装置。分别考察不同浓度(100±10 μg/m3、150±10 μg/m3、200±10 μg/m3)、不同时间(1周、2周、4周、8周、12周)、不同方法(非暴露气管内灌注法和气溶胶吸入法)和不同动物(Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠)对模型建立的影响。观察动物一般状态并计算体重增长率与死亡率；检测肺功能包括呼吸频率、用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)与动脉氧分压(PO2)；计数支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类；光镜检查气管、肺组织病理。以气管、肺组织病理可见到肺炎为建立成功模型标准，确定建立模型的影响因素。结果不同浓度PM2.5气溶胶连续吸入8周，Wistar大鼠出现中毒现象，体重增长缓慢，支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数和单个核细胞计数增加、巨噬细胞比率上升，肺功能指标中呼吸频率增高、动脉血 PO2和 FEV1/FVC降低，病理示气管、肺组织出现炎症及肺纤维化变化，炎症变化与染毒浓度呈正相关但高浓度死亡率高。持续不同时间(1周、2周、4周、8周和12周)吸入相同浓度，Wistar大鼠染毒动物气管肺组织病变8周起显著但与12周无差异。不同方法(非暴露气管内灌注法和气溶胶吸入法) Wistar大鼠连续吸入8周，两法染毒效果相当但吸入法动物死亡率低。Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠不同动物连续吸入8周，三种动物效果相当但Wistar大鼠死亡率低。结论选用Wistar大鼠吸入浓度为150±10 μg/m3的PM2.5气溶胶连续8周可建立合适的PM2.5致机体损伤动物模型，研究制备一个与PM2.5损伤机体相似的致病环境，率先建立既适合全国大范围，同时具有福建地区特点PM2.5致机体损伤动物的模型，将促进PM2.5预防与治疗措施研究的开展。

PM2.5；气溶胶吸入；大鼠；豚鼠；模型

大气灰霾细颗粒物(airborne fine particulate matter,PM2.5)指大气总悬浮颗粒物中直径等于或小于2.5 μm的细颗粒物，来源于人为或自然污染源，其成分复杂而可变[1]。人长期暴露在灰霾环境中可导致呼吸、心血管等多系统疾病，患癌风险增加并可引发早死，其长期效应远远高于短期效应[2-4]，近年来相关研究日见增多。现有一次性、短时间、大浓度暴露法所制建立动物模型，很难动态、系统观察到PM2.5对机体损伤这一长期慢性疾病的病理发生发展全过程，目前国内外均未见PM2.5损害机体的标准动物模型，缺乏稳定的动物模型成为PM2.5损害机体研究的瓶颈问题，限制其防治措施的研究和应用。因此，建立一个适合的动物模型和研究方法，可为评价PM2.5损害机体研究提供客观、准确的研究手段，同时为探讨机制研究提供新思路。本研究针对①选用动物②染毒途径③染毒浓度④染毒持续时间四个核心问题，主要以气管、肺脏组织炎症病理改变为制模成功的标准，总结其变化特点及趋势，研究各相关指标间的相关性，筛选出适合评价PM2.5致机体损伤的动物模型。

1　材料和方法

1.1实验动物

清洁级Wistar大鼠200只，体重(160～180) g，2月龄；清洁级BN大鼠30只，体重(160～180) g，2月龄；普通级豚鼠30只，体重(130～160) g，2月龄。以上动物均雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2012-0011]。饲养于福建卫生职业技术学院SPF级屏障系统动物实验室[SYXK(闽)2012-0006]。

1.2实验仪器

TH-150C大流量 PM2.5 环境采样器(美国 Thermo 公司)；KQ-100DB型超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)；Alpha2-4 型冷冻干燥机 (德国 Christ 公司)； 超细匀浆机(上海洽姆仪器科技有限公司)；日立7080全自动生化分析仪(日本日立公司)；Model J2-21低温高速离心机(德国贝克曼公司)；RM6240-BD生物信号采集分析系统(成都仪器厂)；yuyuE402AI多功能超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1PM2.5的采集及处理

大流量PM2.5 环境采样器在福州市市区连续采样，收集全年所采样品[5]。将载有细颗粒物的玻璃纤维滤膜滤膜剪成约l cm小块，浸泡于纯化水中，超声震荡30 min，共4次，洗脱颗粒物，6层纱布过滤震荡液，集中滤液于4℃、3000 r/min离心20 min后收集下层悬液。采用减量法计算，用生理盐水稀释至所得悬液浓度为555.6 μg/mL，一部分悬液密封，剩余部分悬液置于玻璃平皿中并冷冻真空干燥，均置于低温冰箱保存备用。

1.3.2Wistar大鼠吸入PM2.5动物模型的建立

1.3.2.1动物分组与染毒

Wistar大鼠50只，随机分为正常组、空白组、染毒高浓度组、染毒中浓度组和染毒低浓度组5组，每组10只，标记并分笼饲养。正常组不作处理，空白组和染毒各组动物均采用气溶胶吸入法：用生理盐水配制PM2.5混悬液并灭菌，多功能雾化器将混悬液以1.8 mL/min流速向自制密封容器(容积约5 L)开始喷雾，容器另一端有一个出口以保证容器内气雾正常流动，到玻璃容器内全部充满白色雾为准，气溶胶达到要求浓度，按实验前拉丁方方法安排好的顺序依次将动物放入吸入装置中，自然呼吸，接受染毒，每天6 h(9：00～15：00)，每周5 d，连续8周。染毒浓度根据国标大气中24 h平均浓度必须小于75 μg/m3，取(200±10) μg/m3、(150±10) μg/m3、(100±10) μg/m3分别为高、中、低浓度组。空白组换成生理盐水吸入。

1.3.3观察指标

1.3.3.1一般状态

每日染毒后观察动物的精神状态、饮食情况、活动及死亡变化。计算动物死亡率和实验结束时体重增长率。

1.3.3.2肺功能检测

室温控制于22℃～25℃，动物体温维持约37℃，采用2%巴比妥钠(12 mg/kg)腹腔注射麻醉动物。固定动物，RM6240-BD生物信号采集分析系统观察并记录大鼠呼吸频率、幅度；再解剖暴露气管，检测动物肺功能包括呼吸频率、用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)；而后暴露腹腔，少许肝素钠抗凝，行腹主动脉穿刺取血，血气分析动脉氧分压(PO2)。

1.3.3.3支气管肺泡灌洗液(BALF)制备和指标检测

脱臼处死大鼠，将肺脏完整取出，结扎左侧肺叶并分4次共注入12 mL的预冷PBS缓冲液，按摩肺部以尽量回收BALF。回收液1800 r/min离心10 min，收集底部细胞悬液，取悬液1滴于载玻片上并与预滴1滴的PBS均匀混合，涂血涂片，自然干燥，行吉瑞染色，显微镜下观察，计数白细胞总数、单个核细胞数(主要包括淋巴细胞和单核细胞)。

1.3.3.4支气管、肺组织处理与病理检查

将气管和右侧肺组织浸入福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，常规HE染色，制备5 μm 切片，光镜下观察气管、肺组织病理学形态变化。气管、肺组织病理改变评价标准：“-”气管和肺组织未见明显病变；“+”气管和肺间质有少量炎症细胞，气管粘膜下腺体轻度扩张，肺间质有不多的炎症细胞浸润；“++”气管间质有较多的炎症细胞浸润，部分气管粘膜上皮脱落，固有层腺体中度扩张，肺间质有较多的炎症细胞浸润，部分肺泡代偿性扩张；“+++”气管纤毛柱状上皮增生，间质有大量炎症细胞浸润，固有层腺体增生、扩张，肺间质有大量炎症细胞浸润，肺泡代偿性扩张，部分肺泡融合。

1.3.4不同染毒时间对动物模型建立的影响

Wistar大鼠70只，随机分为正常组、空白组、染毒大组(1周、2周、4周、8周和12周组)7组，每组10只。采用气溶胶吸入法，染毒时间分别为1周、2周、4周、8周和12周，浓度均为150±10 μg/m3。观察指标为死亡率、体重增长率、气管和肺组织病理变化。

1.3.5不同染毒方法对动物模型建立的影响

Wistar大鼠50只，随机分为5组，正常组、吸入法大组、灌注法大组，各大组再分别设空白组与染毒组，每组10只。采用气溶胶吸入法和非暴露气管内灌注法，染毒时间8周。吸入法浓度(150±10) μg/m3。非暴露气管内灌注法：采用乙醚麻醉，动物竖立以保持直立体位，将预吸好的PM2.5悬液1 mL迅速经气管插管注入，左右来回旋转并按摩双肺10次，使PM2.5进入肺内并均匀分布，每天1次，每周5 d。观察指标为死亡率、体重增长率、气管和肺组织病理变化。

1.3.6不同染毒实验动物对动物模型建立的影响

Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠各30只，随机分为Wistar大鼠大组、BN大鼠大组和豚鼠大组，各大组再分别设正常组、空白组与吸入组，每组10只。采用PM2.5气溶胶吸入持续8周，浓度(150±10) μg/m3。观察指标为死亡率、体重增长率、气管和肺组织病理变化。

1.4统计学方法

2　结果

2.1Wistar大鼠PM2.5吸入动物模型的建立

2.1.1一般状态

适时适度浇水，勿使田间受旱，可减轻红蜘蛛危害；加强巡查及时施药，把红蜘蛛消灭在点片发生阶段。药剂可选20%双甲脒乳油1500～2000倍液，或75%克螨特乳油1000～1500倍液，或25%灭螨猛可湿粉1000～1500倍液，或45%超微硫磺胶悬剂400倍液，或20%复方浏阳霉素乳油1000倍液，或5%唑螨酯（霸螨灵）悬浮剂1500～2000倍液，或25%倍乐霸（三唑锡）可湿粉1000倍液。交替喷施2～3次，隔7～10天1次，喷匀喷足。

染毒各组持续吸入 PM2.5气溶胶共8周，前4周动物表现活动减少、精神稍差、静伏少动、食量下降，后4周症状加重，出现明显的精神倦怠、活动减少、皮毛无光泽；动物体重均出现增长缓慢，高浓度组与正常组比较有显著差异性(P< 0.05)；高浓度组动物死亡率10.0%(1/10)。正常组与空白组动物未见明显异常。(表1)

表1　Wistar大鼠体重与死亡率变化结果

注：*P< 0.05，与正常组比较。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表2　Wistar大鼠肺功能指标检测结果

注：*P< 0.05，与正常组比较。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表3　大鼠气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数检测结果

注：*P< 0.05，与正常组比较。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

2.1.2动物肺功能测定

染毒大鼠出现呼吸频率显著加快、FEV1/FVC升高、PaO2减小，高、中浓度组与正常组具有显著性差异(P< 0.05)。空白组与正常组比较无差异性(P> 0.05)(表2)。

2.1.3气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数

肉眼观察BALF，正常组与空白组较清，而染毒动物组较混浊，但均无明显颗粒沉积。BALF细胞计数中，三个染毒浓度组白细胞总数计数和单个核细胞计数均增加，巨噬细胞比率以高、中浓度组上升，均具有显著性差异(P< 0.05)。空白组与正常组比较无差异性(P> 0.05)(表3)。

2.1.4气管、肺组织病理变化

病理光镜观察示：正常组与空白组大鼠气管、肺组织结构较为正常，气管可见柱状上皮细胞，肺泡结构完整，细胞排列较整齐，肺间质偶见炎性细胞；染毒部分动物气管扩张，腔内有炎性细胞和黏性分泌物，柱状上皮细胞出现增生，严重呈假复层状态，出现明显的炎症反应，肺组织肺间质有大量的炎性细胞浸润，间质瘀血水肿，肺间隔增厚，可见成纤维细胞，呈轻度纤维化，以上病理改变随浓度的增加而明显(图1，2)。

注：(A)正常组；(B)空白组；(C)高剂量组；(D)中剂量组；(E)低剂量组。图1　各组Wistar大鼠气管组织病理光镜观察(bar=200 μm)Note.(A)normal group；(B)control group；(C)high group；(D)middle group；(E)low group.Fig.1　The pathological changes of bronchial tissues under light microscope

注：(A)正常组；(B)空白组；(C)高剂量组；(D)中剂量组；(E)低剂量组。图2　各组Wistar大鼠肺组织病理光镜观察(bar=200 μm)Note.(A)normal group；(B)control group；(C)high group；(D)middle group；(E)low group.Fig.2　The pathological changes of lung tissues under light microscope

随染毒时间延长：染毒动物死亡率呈升高，染毒8周死亡率10%，染毒12周死亡率达30%；体重增长率也增长延缓；各组动物气管组织和肺组织病变发生率呈升高(30%、50%、80%、100%、100%和30%、40%、80%、100%、100%)；均值连续染毒4周起变化显著，较正常组有显著差异性(P< 0.05)，且与染毒时间呈一定正相关。空白组与正常组比较，各指标均无显著差异性(P> 0.05)。进行各染毒时间组间均值秩和检验发现气管病变无显著差异性(P> 0.05)，而肺组织病变有显著差异性(P< 0.05)，结合死亡率考虑染尘时间以8周为佳(表5)。

2.3不同染毒方法对PM2.5吸入动物模型的建立影响

采用不同染毒方法：灌注法与吸入法染毒组动物死亡率分别为30%和10%；两染毒组气管和肺组织病变均值都较正常组高且有显著差异性(P< 0.05)。各空白组与正常组比较，各指标均无显著差异性(P> 0.05)。进行两染毒组间均值秩和检验发现无显著差异性(P> 0.05)，考虑两种方法效果相当，因灌注法死亡率高，可选择吸入法为佳(表6)。

表4　Wistar大鼠气管、肺病理变化结果(n=10)

注：*P< 0.05，与正常组比较。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表5　不同染毒时间对PM2.5吸入动物模型建立影响结果(n=10)

注：*P< 0.05，与正常组比较。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表6　不同染毒方法对PM2.5吸入动物模型的建立影响结果(n=10)

注：*P< 0.05，与正常组比较。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

2.4不同染毒实验动物对PM2.5吸入动物模型的建立影响

选用Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠作为实验动物吸入染毒结果：死亡率分别为0%、20%、60%；BN大鼠和豚鼠体重增长率较小；气管和肺组织病变发生率分别为80%、80%、90%和90%、80%、90%。各染毒组间的气管与肺组织病变均值进行组间秩和检验发现无著差异性(P> 0.05)，考虑三种动物效果相当，综合动物死亡率情况，考虑选择Wistar大鼠。各空白组与正常组比较，各指标均无显著差异性(P> 0.05)(表7)。

表7　不同染毒实验动物对PM2.5吸入动物模型的建立影响结果(n=10)

注：*P< 0.05，与正常组比较。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

3　讨论

PM2.5可对机体产生多器官、多靶点的损伤，是一个慢性、长期的病理变化过程，呼吸系统是主要的靶器官，近年来有关于其损伤研究多以肺组织病理可见到肺炎为标准[6-8]，损伤机理主要考虑与氧化应激损伤、炎性反应、体液免疫应答和局部粘膜免疫有关。本研究采用PM2.5气溶胶吸入法，结果发现Wistar大鼠经吸入染毒后，出现全身中毒表现，BALF中白细胞总数计数、单个核细胞计数和巨噬细胞比率上升，气管、肺组织病理学检查结果显示出现明显炎症反应和肺间质出现纤维化病变，病理学改变与肺功能相关性发现随着肺泡炎及肺纤维化程度的加重，动物呼吸频率增高，FEV1/FVC和动脉血 PO2降低，此结果也反映肺部病理变化与肺功能改变的一致性，并进一步证实PM2.5吸入同时引起限制性通气障碍和(或)阻塞性通气障碍、通气/血流比失调及肺间质纤维化肺泡-毛细血管膜增厚而致弥散功能障碍如慢性气管炎、肺气肿等。以气管、肺组织出现炎症病理改变为建立动物模型标准，结果表明PM2.5气溶胶吸入染毒法可引起明显炎症病理改变，动物模型建立合适。

研究考察不同吸入浓度、不同染毒时间、不同品系动物和不同方法对模型的影响。结果吸入浓度与动物病变严重程度、死亡情况呈正相关，高、中浓度动物病变明显且相似，但高浓度动物死亡率较高。考察不同染毒时间实验中，连续染毒8周起动物死亡率和气管、肺组织病变变化显著，但与12周无差异，而染毒12周死亡率达30%。选用目前常用的动物，Wistar大鼠是使用最广泛的大鼠品系之一，其生活习性繁殖规律容易受到外界的气温、气压、湿度、噪声等方面的影响，BN大鼠血清中IgE表达水平较高，更容易模拟过敏的生理状态，在I型超敏反应研究中应用较多，豚鼠有IgG和IgE两种类型的变态反应抗体，适于研究迟发型过敏性和速发型过敏反应，是最常用的评价药物过敏反应的动物模型，结果发现三种动物的气管与肺组织病变相当，但死亡率豚鼠最高，Wistar大鼠最低，考虑豚鼠对PM2.5过于敏感，BN大鼠死亡率较高，以选用Wistar大鼠建模为佳。现有研究的染毒途径主要采用PM2.5悬液经暴露气管注入法或非气管暴露气管内灌注，前者会对动物产生有创损伤，后者则动物可有麻醉过深、气管粘膜损伤出血、混悬液窒息、纵隔血肿、肺部感染等，且两者的死亡率高，也难以模拟实际的病理过程，若采用PM2.5气溶胶吸入法，与实际引起的损伤病理过程更为类同，死亡率也可大大降低，实验比较非气管暴露气管内灌注和慢性气溶胶吸入法，发现气管、肺组织病变率相似，故认为两者效果相似，吸入法较灌注法动物死亡率低，且可更真实的反映病理过程，更适合用于建立模型。

本研究制备一个与自然条件相似的致病环境进行PM2.5气溶胶吸入，结果表明选用Wistar大鼠吸入浓度为(150±10) μg/m3的PM2.5气溶胶持续8周可建立合适的PM2.5致机体损伤动物模型。模型可适合全国大范围使用，同时PM2.5成分因不同地区的有所不同，采用本地区来源的PM2.5建模具有地区特色，为本地区PM2.5的预防和治疗方法开展研究奠定基础。PM2.5致机体损伤是多靶器官的，除呼吸系统外其它的靶器官确立及其损伤机理研究均有待后续研究。

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[3]Madrigano J，Kloog IGoldberg R，Coull BA．Long-term exposure to PM2.5 and incidence of acute myocardial infarction[J]．Environ Health Perspect，2013，121(2):192-196．

[4]刘晓莉，李红，孟紫强．PM2.5对大鼠心、肺、睾丸的氧化损伤作用[J].中国环境科学，2005，25(2)：160-161．

[5]王宏，陈晓秋，隋平，等.PM2.5简介及福州市PM2.5污染分布特征[J]．海峡科学，2012，8(66)：20-22.

[6]姜智海，宋伟民．核转录因子-kappa B在PM2.5染毒小鼠急性肺损伤中的作用[J]．环境与职业医学，2005，12，22(6)：483-485.

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Establishment and evaluation of animal model induced by inhalation injury of airborne fine particulate matter

DENG Yuan-rong1，LI Yong-lin1，HUANG Xiao-min1，XU Xun-yu2*

(1. Fujian Health College, Fuzhou 350101, China; 2. Department of Thoracic Surgery, Fujian Provincial Hospital;Provincial Clinical Medical College of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China;)

Objective To establish and evaluate the animal model induced by inhalation injury of airborne fine particulate matter (PM2.5). Methods We manufactured equipment for rats aerosol inhalation with PM2.5. The effects of several facters such as concentrations(100±10 μg/m3、150±10 μg/m3、200±10 μg/m3)、time(1w、2w、4w、8w、12w)、method (non-exposed intratracheal instillation method and aerosol inhalation) and animals (Wistar rats, BN rats and guinea pigs) were investigated to establish the model. The respiratory rate, forced vital capacity ratio of forced expiratory volume (FEV1/FVC) and arterial partial pressure of oxygen (PO2) were measured, the pathological changes of bronchial and lung tissues under light microscope were observed. The success animal model was builded as the pneumonia was observed from the pathological changes of lung tissue. ResultsThe Wistar rats exposed to PM2.5 aerosol inhalation for 8 weeks, we can see that the weight growth rate of rat decreased, WBC count and mononuclear cells countincreased, the macrophages ratio decreased in BALF, the respiratory rate of lung increased while arterial PO2and FEV1/FVC decreased, inflammation and pulmonary fibrosis changes were observed by bronch and pulmonary pathology, inflammatory changes with a dose-response relationship were observed. Exposed to PM2.5 aerosol inhalation for different time(1 w、2 w、4 w、8 w、12 w)with same dose, the score issue lesions of lung and bronchus in Wistar rats increased and the 8w group is obvious. The Wistar rats exposed to PM2.5 with different method (aerosol inhalation and non-exposed intratracheal instillation method) for 8w, the aerosol inhalation worked as effectively as perfusion while mortality rate of aerosol inhalation is lower. Different animals (Wistar rats, BN rats and guinea pigs) exposed to PM2.5 aerosol inhalation for 8w, the same results were observed with three method respectively while mortality rate of Wistar rats lower. ConclusionsThe optional conditions that the Wistar rats were continuously inhaled for 8w PM2.5 with a dose of 150±10 μg/m3were established. The animal model could be used on a national scale, especially in Fujian province. The results would be useful for the development of the research of the prevention and countermeasures of PM2.5 pollution.

PM2.5; Aerosol inhalation; Rat; Guinea pigs; Model

福建省实验动物研究科技计划重点项目(2013Y0085)；福建省科技计划引导性项目(2015Y0004)。

邓元荣(1979-)男，硕士，副教授，专业：新药药理研究。E-mail: dyr777@163.com。

徐驯宇(1968-)男，博士，主任医师，副教授，专业：心胸外科。E-mail: xunyux@126.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0042-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.008

2016-04-01