赵印泉　张启翔

摘要：以梅花的花朵为材料，采用RT-PCR与RACE相结合的方法，从“三轮玉蝶”梅花的花朵中克隆到1个全长1 322 bp的氧-甲基转移酶cDNA，命名为PmOMT，该基因编码377个氨基酸的开放性阅读框，具有植物氧-甲基转移酶基因典型的3个保守基序，与月季（R. chinensis var. spontanea）的甲基（异）丁香酚转移酶基因RcOMT1具有较高的同源性。构建系统发育进化树结果表明，PmOMT与RcOMT1亲缘关系最近，同属COMTs类基因。荧光定量PCR分析发现，PmOMT基因的相对表达量与甲基丁香酚色谱峰面积的变化趋势相似，推测该基因可能参与甲基丁子香酚的生物合成。

关键词：梅花；氧-甲基转移酶；基因克隆；器官；丁子香酚

中图分类号： S685.170.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0022-04

梅花（Prunus mume）是我国的传统名花，具有怡人香气，释放大量包括（异）丁香酚和甲基（异）丁香酚在内的苯基/苯丙烷类芳香族化合物[1]，这些芳香族化合物是植物花香的重要成分，并作为信号因子引诱蛾类完成授粉[2]。氧-甲基转移酶（O-methyltransferases，OMTs）是植物酚类衍生物形成过程中重要的一类酶，会将腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-l-methionine）的甲基转移到酚类化合物的羟基上，形成类黄酮化合物、木质素和花香化合物等3类酚类衍生物[3-5]，这些酚类衍生物在植物生长发育以及与环境的信息交流方面发挥着重要作用。本研究在前期梅花花香成分研究的基础上，以“三轮玉蝶”梅花的花朵为材料，对梅花氧-甲基转移酶全长基因进行克隆，应用荧光定量PCR技术分析该基因在梅花不同器官中的表达，旨在为进一步研究梅花花香基因功能及其形成的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

三轮玉蝶梅花种植于北京林业大学校园内，取梅花开花指数2～3级的花朵[1]、根、茎、叶片、花瓣、雄蕊、雌蕊、花萼，用锡箔纸包好，液氮速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱，备用。RNA Easy Kit试剂盒，购自北京盖宁公司；普通cDNA第一链的合成试剂盒，购自MBI公司；pGM-T克隆试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA Marker、Escherichia coli TOP10感受态细胞，均购自北京天根生物公司；Go Taq Flexi DNA Polymerase、Pfu DNA Polymerase、DNaseⅠ，购自Promega公司；3′-Full RACE Core Set Ver.2.0、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，购自TaKaRa公司；扩增引物，由北京奥科生物公司合成；SYBR Green I 染料，Invitrogen公司生产；分析纯级的其他试剂，均为国产。用于提取RNA的溶液，均用0.1% DEPC处理的水配制；离心管、枪头等塑料制品，均用0.1% DEPC浸泡过夜，高压灭菌，备用。

1.2 梅花PmOMT基因cDNA全长的获得

按照RNA Easy spin kit试剂盒的说明提取花朵总RNA，用DNase Ⅰ酶去除RNA中的痕量DNA；用M-MLV反转录酶对1 μg总RNA进行反转录，获得第一链cDNA；根据GenBank中检索到的仙女扇（异）甲基丁香酚（登录号：U86760）和月季花氧位甲基转移酶基因（登录号：AB086103）核苷酸和氨基酸保守序列，设计1对兼并引物为OMT1：5′-STTGTKGATGTTGGGGGBGGGCTAGG-3′和OMT2：5′ -ACAACWATBACYTTBCCATTRTCVGG-3′，以cDNA第一链作为模板进行PCR扩增；根据获得的保守序列，设计3′-RACE特异引物为OMT3：5′-AGGGTATCAATTTCGACTTGCC-3′，按3′-Full RACE Core Set Ver.2.0说明书进行操作，获得3′端序列；将保守区序列和3′-RACE序列进行拼接，按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书设计2个特异引物为OMT4：5′-GCTTTAGGCAGTGCTCATCGCTC-3′和OMT5：5′-CACTCCAGGATAGGAAGGGGCAT-3′，分别与试剂盒中的引物进行扩增，获得5′端序列；所有扩增产物经回收、纯化，连接pGM-T载体，转化Escherichia coli TOP10感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，送北京奥科公司进行测序。根据3′端和5′端拼接序列设计2条特异引物为OMT6：5′-GAACGTAAACATAGACAGTCCA-3′和OMT7：5′-AGTGTGTAAGTTTTCATATGCCT-3′，PCR扩增、克隆、测序，获得梅花氧-甲基转移酶基因cDNA全长编码序列。将测序得到的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别在NCBI上用Blast软件进行同源性检索，序列拼接、分析和同源性比较用DNAMAN软件完成；采用Mega 4.0软件构建植物OMTs类似基因蛋白的分子系统进化树。

1.3 荧光定量PCR表达分析

通过Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）软件获得与OMTs基因的相似序列，在基因的编码序列中跨内含子设计2条OMTs基因特异引物分别为OMT8：5′-TTCCCTCCCGGATTTTGAG-3′和OMT9：5′-TCGACTTGCCCCATGTTGTA-3′，目标片段为294 bp；以GAPDH作为内参基因设计引物GAPDH gsp1：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3和GAPDH gsp2：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，目标片段为 440 bp。对PCR扩增产物凝胶检测和测序，进一步验证引物设计的特异性，同时根据CT值绘制标准曲线。总量为20 μL 的荧光PCR反应体系为：H2O 12.1 μL；10 pmol/L上游引物 0.2 μL，10 pmol/L 下游引物0.2 μL；20×SYBR染料05 μL；2.5 mmol/L dNTP 0.4 μL；25 mmol/L MgCl2 24 μL；10×buffer 2.0 μL，5 U/μL Taq酶 0.2 μL，模板 2.0 μL。利用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System荧光定量PCR仪进行扩增，反应程序为：95 ℃ 120 s，1个循环；95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，40个循环，72 ℃读取荧光值；循环结束，60 ℃保温60 s，进行熔解曲线分析，检测每份样品的OMTs基因和内参基因CT值。每份样品重复3次。根据标准曲线计算定量结果平均值、校正值、标准差，使用Microsoft Excel 2007软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 梅花PmOMT基因cDNA全长的获得及序列分析

结果表明，以梅花的花朵cDNA为模板，OMT1、OMT2为引物进行PCR扩增，获得1个300 bp大小的片段，经Blast比对，该片段与其他植物OMTs基因有较高的同源性；3′-RACE获得含Poly（A）尾大小为581 bp的3′端序列，5′-RACE获得1个829 bp的5′端序列；用DNAMAN软件进行拼接，设计1对特异引物PCP扩增，最终获得1条长为1 322 bp的基因全长cDNA序列，GenBank登录号为GU339212，命名为PmOMT，该基因完整的开放阅读框长1 134 bp，编码377个氨基酸（图1），5′端非编码区长23 bp，3′端非编码区长 165 bp。

2.2 PmOMT编码氨基酸的同源性分析

由图2可见，PmOMT基因编码的氨基酸序列与其他物种的氧-甲基转移酶具有较高的同源性，其中，与催化形成甲基（异）丁香酚的月季花氧-甲基转移酶基因RcOMT1、RcOMT3同源性分别为67.6%、67.8%；PmOMT具有植物OMTs典型的3个保守基序。

2.3 PmOMT蛋白系统进化树的构建

由图3可见，OMT基因编码的氨基酸序列明显分为2个类群，COMTs是氧-甲基转移酶蛋白序列，OMTs是类黄酮蛋白序列；PmOMT与RcOMT1遗传距离相对最近，同属氧-甲基转移酶基因类。

2.4 PmOMT在梅花不同组织中的特异性表达

以GAPDH基因作为内参照，采用荧光定量PCR 方法对梅花不同组织中PmOMT的表达进行检测。由图4可见，PmOMT基因在所有组织均有表达，相对表达量由高到低依次为雄蕊、花瓣、雌蕊、萼片、叶片、茎、根，生殖器官组织的PmOMT基因相对表达量高于营养器官组织。

3 结论与讨论

从梅花的花朵中克隆得到的PmOMT基因具有植物OMTs基因典型的3个保守基序，与大多数植物的OMTs基因具有较高的同源性，其中，与同属蔷薇科的月季花甲基（异）丁香酚氧-甲基转移酶RcOMT1和未知功能的RcOMT3基因同源性相对最高。将PmOMT与部分已知功能的植物OMTs作氨基酸序列分子进化树发现，PmOMT属于咖啡酸氧-甲基转移酶（COMTs）1类，且在选取的梅花组织中均有表达。有研究表明，COMTs亚家族基因对苯环上含有2个邻位羟基的底物具有优先催化的特性，香草兰（Vanilla planifolia）COMTs基因优先以3，4-二羟基-苯甲醛为底物形成香草

醛[6]，以3，4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛为底物形成丁香醛[7]，这种特性在金腰属（Chrysosplenium americanum）、杨树（Populus deltoids）、月季花、草莓（Fragaria×ananassa）等植物[8-11]上都有表现。

梅花PmOMT基因参照月季花RcOMT1基因采用同源克隆法克隆，与RcOMT1具有最高的同源性和亲缘关系，且PmOMT基因在三轮玉蝶梅生殖器官的表达量高于营养器官。（异）丁香酚和甲基（异）丁香酚都是梅花的花香产物，（异）丁香酚在苯基上含有2个邻位羟基，鉴于COMTs亚家族基因对苯环上含有2个邻位羟基的底物具有优先催化的特性，因此初步认为PmOMT基因属于COMTs基因，但是否能直接决定花香的形成仍须进一步探究。

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