杨卫红　李培岭　李树军

新乡医学院第一附属医院1儿科，2小儿内一科，3小儿内三科，河南　新乡　453100

外周血铁调素25 mRNA及蛋白表达水平在白血病患儿中的临床价值

杨卫红1#李培岭2李树军3

新乡医学院第一附属医院1儿科，2小儿内一科，3小儿内三科，河南新乡453100

目的观察急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿外周血铁调素25（Hepc-25）mRNA和蛋白表达情况，并探讨其与ALL化疗疗效的关系。方法选取接受MR方案治疗的白血病患儿93例作为观察组，另选取同期20例健康体检儿童作为对照组。采用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）测定两组外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平。分析Hepc-25与ALL疗效的关系。结果白血病患儿外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；经治疗好转组患儿外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表达水平较治疗前均下降（P＜0.05）；而治疗无效组患儿Hepc-25 mRNA及蛋白表达水平较治疗前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论ALL患儿外周血Hepc-25过表达对疾病复发有一定的预测价值，与白血病患儿的化疗疗效有密切关系。

急性淋巴细胞白血病；患儿；Hepc-25；化疗疗效

Oncol Prog，2016，14（4）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，其特点是骨髓及其他造血组织中大量无核细胞增殖失控，分化障碍，凋亡受阻，停止在细胞发育的不同阶段，而白血病细胞大量增生累积，并浸润其他组织和器官，进而导致正常造血功能受到抑制。主要临床症状有不同程度的贫血、出血、感染、发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛［1-2］。白血病的发病率在儿童恶性肿瘤中占首位，且病死率高，是5岁以上儿童死亡的主要原因之一。近年来对白血病的研究主要集中在临床诊断和治疗方面，其相关流行病学、病因学的研究也获得了一些进展［3-5］。铁调素（hepcidin，Hepc）是一种由肝脏细胞产生的具有广谱杀菌抑菌作用的抗菌肽，可以抑制肠道铁吸收和单核巨噬细胞系统铁释放，是一种重要的负性铁调节激素［6-7］。此外，慢性感染、炎症、缺氧以及其他慢性疾病所引起的贫血也与Hepc有密切联系，近几年的研究证实，Hepc过表达可作为炎症引发贫血的重要病理指标，而Hepc缺乏则导致多数家族性血色沉着病和无效性红细胞生成性贫血伴随铁离子吸收增加，其中，Hepc-25是其主要活性部分［8-10］。目前，国内外对Hepc-25在白血病中的发生与疾病进展机制研究鲜见报道，本研究观察分析了白血病患儿外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表达情况，并探讨其在白血病疾病发展以及治疗中的临床意义。现报道如下。

1　对象与方法

1.1研究对象

经新乡医学院第一附属医院医学伦理委员会批准，选取2011年2月至2014年2月该院接受治疗的白血病患儿93例作为观察组。入选标准：①所有患儿均根据儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订草案）确诊为ALL［11］；②排除慢性炎症、贫血或者其他自身免疫性疾病患儿；③排除肝功能异常患儿；④所有参与研究者均由家长签署知情同意书。观察组男性63例，女性30例，年龄2～13岁，平均年龄（8.7±2.4）岁。所有患儿均根据文献［11］的标准化疗方案进行治疗。同时随机选取接受体检的20例健康儿童作为对照组。

1.2仪器与试剂

人淋巴细胞分离液购自美国MP Biomedicals公司；SYBR Green通用型qPCR Master M ix购自Roche生物公司；RT-PCR扩增仪购自Bio-Rad公司；逆转率试剂盒购自TAKARA公司；Hepc-25蛋白ELISA试剂盒购自美国R&D公司。

1.3检测方法

1.3.1RT-PCR分析外周血Hepc-25 mRNA变化抽取观察组患儿治疗前与治疗后抗凝外周血各5 m l，并抽取对照组健康儿童外周血作为对照。根据RNA提取试剂盒说明书和逆转录试剂盒提取RNA，并逆转录为cDNA。根据GeneBank提供的Hepc-25序列，设计如下引物：Hepc-25-F：5'-ACGGCACGATCGCACTGAGC-3'；Hepc-25-R：5'-TCGCCTCCTTCGCCTCTGGA-3'。β-Actin-F：5'-GCGGGAAATCGTGCGTGAC-3'；β-Actin-R：CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'。采用实时荧光定量PCR仪分析Hepc-25mRNA的表达水平。

1.3.2ELISA分析外周血Hepc-25蛋白表达水平抽取观察组患儿治疗前和治疗后抗凝外周血各2 m l，于4000 r/m in离心10 m in，取血清用于ELISA检测，严格规范采用ELISA检测Hepc-25蛋白表达情况，每个样本和标准品均设置3个复孔，并于酶标仪上以492 nm波长测OD值。采用同种方法检测对照组儿童外周血Hepc-25蛋白表达水平。

1.4随访与观察终点

治疗后根据《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第三次修订草案）》疗效评判标准进行疗效评价［11］，分为完全缓解、部分缓解和未缓解。好转率=（完全缓解+部分缓解）例数/总例数×100%，未缓解视为治疗无效。随访至2014年12月，对93例患儿均完成全部随访观察，随访率为100%。

1.5统计学方法

所有数据均采用SPSS13.0软-件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用t检验。相关性分析采用Pearson方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组儿童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平比较

结果显示，观察组患儿外周血Hepc-25 mRNA水平高于对照组健康儿童（P=0.008）；观察组患儿外周血Hepc-25蛋白表达水平亦高于对照组健康儿童，差异有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1　两组儿童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白水平比较（±s）

表1　两组儿童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白水平比较（±s）

组别对照组（n=20）观察组（n=93）Hepc-25 mRNA 1.01±0.32 5.48±1.01 Hepc-25蛋白（μg/m l）1.14±0.35 3.15±0.79

2.2观察组患儿治疗前后外周血Hepc-25 m RNA和蛋白表达水平比较

观察组患儿经治疗后随访结果显示，完全缓解14例，部分缓解47例，未缓解32例。好转率为64.89%。根据疗效评价结果将观察组分为好转组（61例）与无效组（32例），好转组患儿治疗前外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平均低于无效组患儿，差异有统计学意义（P=0.014、P=0.007）；治疗后好转组患儿Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平亦低于治疗前（P＜0.01、P=0.012）；而无效组患儿Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平较治疗前比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2）2.3 Hepc-25 m RNA及蛋白表达水平与疗效的关系

表2　观察组不同疗效患儿外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平比较（±s）

表2　观察组不同疗效患儿外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平比较（±s）

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如上结果所述，Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平较高的患儿疗效较差，而Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平较低的患儿疗效较好。相关性分析显示Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平与患儿的疗效呈负相关（r=-1.032，P＜0.05）。

3　讨论

急性淋巴细胞白血病是造血系统中恶性增生性疾病，亦是一个多因素，发病机制复杂的儿童最常见的恶性肿瘤。该病具有病程长、反复发作、需长期治疗的特点，直接影响了儿童的身体发育、心理发展和社会适应能力，从而降低儿童的生存质量。近年来该病发病率呈上升趋势，因此越来越受到研究人员的重视，但其致病因素仍无定论，因而较缺乏针对性的病因预防手段［12-13］。根据白血病细胞不成熟的程度和自然病程，将白血病分为急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病两类。由于白血病细胞恶性、无限制地增生，浸润全身组织和脏器，直接影响了重要器官的功能以及正常血细胞的产生数量，使血细胞发生量与质的变化，从而导致患者出现贫血、出血和感染症状［14］。

Hepc-25具有广谱杀菌、抑菌作用，属于防御性蛋白家族。目前国内外多项研究已证实Hepc-25是Hepc的主要活性成分。Hepc由肝细胞分泌，又叫肝脏抗菌多肽。Hepc作为一种炎症急性期反应蛋白，积极参与了机体对贫血、组织缺氧和炎症的反应，不仅是铁代谢重要的负性调节激素，而且在固有免疫、慢性炎症性贫血等与铁代谢相关性疾病中也具有一定作用［15-17］。研究显示，贫血、组织缺氧和炎症均可影响肝脏Hepc产生。此外，学者们亦发现Hepc-25还与多种炎性和转录因子相关，它们共同影响了炎性反应的发生［18-20］。Nicolas等［21］对慢性炎症和贫血小鼠尿液的分析结果显示，与对照组比较，Hepc的升高可达100倍，而在较轻的炎性疾病中，尿液中Hepc-25相应减少，且与血清急性期反应蛋白-铁蛋白水平成正比。陈姣等［22］采用RT-PCR和ELISA法分析了54例多发性骨髓瘤患者外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表达水平，研究Hepc-25的动态变化与患者临床表现的相关性及对预后的临床预测价值，结果发现，患者的Hepc-25蛋白表达水平高与慢性贫血密切相关，且较高水平的Hepc-25蛋白表达对临床复发具有一定的预测价值，并与患者疗效、预后有密切关系。

本研究检测了白血病患儿外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平，研究结果显示，与对照组比较，白血病患儿外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平均升高，提示Hepc-25蛋白表达水平是白血病发生过程中较敏感指标，并有可能成为白血病临床辅助诊断指标。另外，本研究结果发现，好转组患儿Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平低于无效组患儿，提示Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平可作为临床判断白血病患儿化疗疗效的预测指标。好转组患儿在接受治疗后Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平下降，无效组患儿治疗前后Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平比较差异无统计学意义。进一步说明Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平与白血病患儿化疗疗效存在密切关系，原因可能是Hepc-25蛋白是一种炎症急性期蛋白，其水平代表患儿机体炎性水平的高低，炎性水平愈高，则治疗效果越不佳。

综上所述，白血病患儿体内Hepc-25 mRNA和蛋白表达水平高于正常儿童，且与患儿的化疗疗效密切相关，对白血病患儿的临床治疗与复发诊断亦具有指导意义。

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The clinical significance of the expression of Hepc-25 mRNA and protein in peripheral blood of children w ith leukem ia

YANG Wei-hong1#LI Pei-ling2LI Shu-jun3
1Department of Pediatrics，2Department of Pediatric First Medical，3Pediatric Third Medical，First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453100，He'nan，China

Objective To study the expression of Hepc-25 mRNA and protein in peripheral blood of children w ith leukemia and to explore the correlation between expression level and efficacy of chemotherapy.Method 93 cases of children w ith leukemia who were administered w ith MR regimen were included as study group，while another 20 cases of healthy children were enrolled as control group；peripheral blood was extracted to determine the Hepc-25 mRNA and protein levels using RT-PCR and ELISA；the correlation between Hepc-25 and efficacy was analyzed.Result Hepc-25 mRNA and protein levels in study group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.After treatment，Hepc-25 mRNA and protein levels in children w ith response were significantly decreased（P＜0.05），and there were no significant differences before and after treatment in children w ithout response（P＞0.05）.Conclusion The expression of Hepc-25 in peripheral blood of children w ith leukem ia is high，which is useful in predicting recurrence，and is closely correlated w ith the efficacy of chemotherapy.

acute lymphoblastic leukem ia；children；Hepc-25；efficacy

R733.7

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.19

2015-07-06）

（corresponding author），邮箱：YWH120@163.com