吐尔逊江·艾力　地力下·司马义　帕孜来提·阿布都热西提　司马义力·买买提尼亚孜#新疆医科大学附属肿瘤医院内科，教育部重点实验室，乳腺放疗科，乌鲁木齐　800

乳腺癌患者血浆微泡BCRP mRNA水平的改变及其临床分析△

吐尔逊江·艾力1地力下·司马义2帕孜来提·阿布都热西提3司马义力·买买提尼亚孜3#
新疆医科大学附属肿瘤医院1内科，2教育部重点实验室，3乳腺放疗科，乌鲁木齐830011

目的探讨血浆微泡乳腺癌耐药蛋白（BCRP）mRNA水平与乳腺癌化疗疗效及乳腺癌组织相关基因的关系。方法选择接受新辅助化疗的乳腺癌患者60例作为乳腺癌组，选择同时期健康体检者60例作为对照组。检测血浆微泡BCRP mRNA转录水平以及乳腺癌组织相关基因中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9和增殖相关基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量。结果乳腺癌组患者血浆微泡中BCRP mRNA含量高于对照组，差异有统计学意义（t=31.289，P＜0.05）；CR/PR组患者血浆微泡中BCRP mRNA含量低于SD/PD组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；乳腺癌组织中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量低于癌旁正常组织，增殖相关基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论血浆微泡中BCRP的mRNA含量与caspase-3、caspase-9 mRNA含量呈负相关，与Survivin、Bcl-2 mRNA含量呈正相关。血浆微泡中BCRP mRNA含量可作为乳腺癌辅助化疗疗效的预测指标，为乳腺癌化疗提供指导依据。

乳腺癌；化疗；乳腺癌耐药蛋白；增殖；凋亡

Oncol Prog，2016，14（4）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，手术切除联合化疗、生物治疗能够有效地控制病情、延长生存时间、预防肿瘤复发。但是，仍有部分乳腺癌患者在化疗过程中出现化疗药物耐药，进而造成化疗效果不佳［1］。多药耐药一直是影响乳腺癌化疗效果的重要因素，探明乳腺癌患者多药耐药的原因以及在耐药过程中发挥关键作用的分子是临床乳腺癌化疗的研究热点［2］。乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）与乳腺癌化疗耐药密切相关［3］，本研究分析了血浆微泡乳腺癌耐药蛋白mRNA转录水平对乳腺癌化疗疗效的预测价值。

1　对象与方法

1.1研究对象

选择2012年3月至2015年3月来新疆医科大学附属肿瘤医院治疗，经病理活检确诊为乳腺癌并接受新辅助化疗的60例患者作为研究的对照组，住院接受TA（紫杉醇+阿奇霉素）或TE（紫杉醇+表柔比星）化疗方案，化疗4个周期后评价效果并进行手术切除治疗。选择同期在我院体检的60例健康者作为研究的健康对照组。乳腺癌组：年龄21～65岁，平均（45.82±6.65）岁；体质量指数（BMI）20 kg/m2～26 kg/m2，平均（22.15±3.42）kg/m2；临床分期：Ⅱ期8例，Ⅲ期52例；病理类型：浸润性导管癌51例，浸润性小叶癌5例，其他4例。对照组：年龄21～70岁，平均（45.90±6.25）岁；体质量指数（BMI）20 kg/m2～27 kg/m2，平均（22.89±3.19）kg/m2。乳腺癌患者有明确的病理诊断，本研究经医院伦理委员会批准，且所有受试对象均签署知情同意书。两组受试者年龄、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

>1.2仪器和材料

RNA提取试剂为Invitrogen公司生产；反转录和PCR扩增的试剂购自Promega公司（引物序列：R：5´-GACTGGATGAGGTCGTCCGTTTCC-3´；F：5´-CAGCCGTGGAACTCTTTGGGTAGAGAAG-3´）；PCR仪购自Bio-rad公司；Ultra SYBR Mixture（With ROX）购自北京康为世纪生物科技有限公司；小鼠抗BCRP单克隆抗体购自英国Abcam公司；乳胶珠购自美国Life Technologies公司。

1.3实验方法

1.3.1血浆微泡采集方法采集受试对象空腹外周静脉血，置于EDTA抗凝管中，3000 r/min离心3 min后得到血浆，按照血浆与磷酸盐缓冲液（PBS）1:2的比例稀释血浆样本，而后用500 g离心10 min并弃去细胞碎片，2000 g离心30 min并弃去血小板，10000 g离心70 min获取沉淀，用20 μl PBS重悬后保存在-80℃冰箱待用。

1.3.2肿瘤标本采集方法术中采集乳腺癌组织和癌旁正常组织，经病理学检查确认组织性质后，用生理盐水清洗组织，在液氮中迅速冷冻，最后保存在-80℃。

1.3.3mRNA水平检测方法微泡标本和组织标本分别用Trizol裂解液提取总RNA，采用MMLV试剂盒进行反转录并得到cDNA标本，按照实时定量PCR方法进行扩增，扩增的基因包括BCRP、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、Bcl-2，得到扩增曲线并对基因的mRNA相对含量进行计算。

1.4评价标准

临床疗效参照WHO实体瘤疗效评价标准［4］，完全缓解（CR）：化疗后肿瘤病灶完全消失；部分缓解（PR）：肿瘤两个最大横径乘积减少大于50%；疾病稳定（SD）：化疗后肿瘤两个最大横径乘积减少小于50%或增大小于25%；疾病进展（PD）：化疗后肿瘤最大两个横径乘积增大大于25%。

1.5统计学方法

采用SPSS 20.0软件录入数-据并进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，相关性分析可采用Pearson相关分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1乳腺癌组和对照组血浆微泡中BCRP mRNA含量比较

乳腺癌组患者血浆微泡中BCRP mRNA相对含量为（254.56±34.52），高于对照组的（100± 16.62），差异有统计学意义（t=31.289，P＜0.05）。

2.2乳腺癌组不同化疗效果患者的血浆微泡中BCRP mRNA含量比较

60例乳腺癌患者化疗两个周期后按RECIST标准评价分为疗效较好的CR/PR组42例（70.00%）和疗效较差的SD/PD组18例（30.00%）。CR/PR组患者血浆微泡中BCRP mRNA含量为（173.77± 20.99），低于SD/PD组患者的（328.49±40.19），差异具有统计学意义（t=19.603，P＜0.05）。

2.3乳腺癌组癌组织与癌旁正常组织中凋亡、增殖基因的mRNA含量比较

乳腺癌组织中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量低于癌旁正常组织，增殖相关基因Survivin、Bcl-2的mRNA含量高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01），详见表1。

2.4血浆微泡中BCRP mRNA含量与凋亡基因和增殖基因mRNA含量的相关性

血浆微泡中BCRP mRNA含量与组织中的caspase-3、caspase-9 mRNA含量呈负相关，与Survivin、Bcl-2的mRNA含量呈正相关。详见表2。

表2　血浆微泡中BCRP mRNA含量与凋亡基因和增殖基因mRNA含量的相关性分析

表1　乳腺癌组癌组织与癌旁正常组织中凋亡、增殖基因的mRNA含量比较（±s）

表1　乳腺癌组癌组织与癌旁正常组织中凋亡、增殖基因的mRNA含量比较（±s）

组别癌组织癌旁正常组织凋亡基因Caspase-3 32.42±4.49 100±14.48 Caspase-9 25.69±3.05 100±16.04增殖基因Survivin 242.59±34.23 100±15.69 Bcl-2 309.59±44.23 100±17.06

3　讨论

对于具有潜在手术机会的局部晚期乳腺癌手术患者而言，通过术前化疗药物的使用能够缩小原发肿瘤病灶及转移淋巴结体积，进而降低肿瘤TNM分期、提高手术切除的彻底性［5］。对于接受乳腺癌根治手术的患者而言，术后继续接受新辅助化疗和生物靶向治疗能够有效抑制残留的微小病灶，预防肿瘤复发并延长患者生存时间［6］。综合治疗对于改善乳腺癌患者的预后具有重要价值，但是仍有部分患者在接受综合治疗后的效果欠佳，容易发生复发和转移，其主要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性，药物无法有效抑制癌细胞［7］。

近年来，乳腺癌患者在化疗过程中出现多药耐药的现象受到了越来越多的重视，多药耐药极大地影响了乳腺癌患者的化疗效果［8］。相关研究显示，多基因表达异常与乳腺癌多药耐药的发生有关［9］，其中乳腺癌耐药蛋白是一类位于细胞膜表面的耐药相关分子，由BCRP基因编码，该蛋白的主要功能是介导细胞膜内外药物的转运过程，具体过程为：BCRP通过水解ATP所提供的能量来将细胞内的药物转运至细胞外［10］。这一过程能够降低细胞内药物的浓度，若癌细胞的细胞膜上大量表达BCRP，则会造成化疗药物在癌细胞内的浓度降低，无法产生有效的杀伤效应，进而表现为癌细胞对化疗药物的耐药［11］。最新研究显示，细胞微泡与肿瘤的发生和转移等病理过程密切相关。微泡是一种大多数细胞在生理或病理状态下都会分泌的直径在30～1000 nm之间的微小囊泡总称，包括微粒（microparticle）或脱落小泡（shed vesicle）和外泌体（exosome），作为一种重要的细胞间通讯介质，介导细胞间遗传物质的水平转移，使相邻细胞共享遗传物质，以达到组织内相邻细胞和不同细胞之间功能的相互协调。微泡可由细胞自发或激活因子的刺激下生成与释放，是有“策略”地、主动地外排［12］，微泡膜上携带有母体细胞来源的抗原、脂质，其内含有核酸等生物大分子对疾病发生发展的影响成为研究热点。有研究显示肿瘤来源的血浆微泡与癌变、转移等病理过程密切相关，在肿瘤发病机制研究中越来越受到人们的重视［13］。

本研究主要分析了乳腺癌患者血浆微泡中乳腺癌耐药蛋白mRNA转录水平对乳腺癌化疗疗效的预测价值。首先，比较了乳腺癌患者和健康对照组血浆微泡乳腺癌耐药蛋白的mRNA水平，结果显示，乳腺癌组患者血浆微泡中BCRP mRNA含量高于对照组，这就初步明确血浆微泡乳腺癌耐药蛋白mRNA水平增加与乳腺癌的发生密切相关。为了进一步明确血浆微泡乳腺癌耐药蛋白与化疗效果的关系，分析了不同化疗效果患者血浆微泡中BCRP mRNA含量，结果显示，CR/PR组患者血浆微泡中BCRP mRNA含量低于SD/PD组，提示血浆微泡中BCRP mRNA含量越低，化疗效果越好，汪林军［14］等文献报道新辅助化疗者BCRP mRNA含量（-2.32±0.75）明显低于姑息化疗者（-5.75±0.38），疾病控制组mRNA含量（-4.03± 0.71）明显高于进展组（-6.30±0.44），与本文研究结果基本一致。

乳腺癌患者出现化疗效果不佳、多药耐药后，化疗药物对癌细胞的杀伤作用减弱，原本对凋亡基因表达激活的作用以及对增殖基因表达抑制的作用减弱或丧失［15］。为了进一步明确血浆微泡中BCRP mRNA含量与化疗效果的关系，我们分析了BCRP mRNA含量与凋亡、增殖基因mRNA含量的关系。通过检测乳腺癌组织和癌旁正常组织中凋亡、增殖基因mRNA含量，得出乳腺癌组织中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量低于癌旁正常组织，增殖相关基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量高于癌旁正常组织，根据相关性分析得出，血浆微泡中BCRP mRNA含量与凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量呈负相关，与增殖基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量呈正相关。

综上所述，血浆微泡乳腺癌耐药蛋白BCRP mRNA水平与乳腺癌的发生以及化疗耐药有关，BCRP mRNA水平越高、化疗效果越差。提示血浆微泡中BCRP mRNA含量可以作为乳腺癌辅助化疗疗效的预测指标，为乳腺癌化疗提供指导依据。

［1］龚建平，姚宇锋，唐金海，等.术前化疗对乳腺部组织激素受体及耐药基因蛋白表达的影响［J］.中国肿瘤临床，2013，39（23）:1896-1898.

［2］胡巍，覃永坚.乳腺癌耐药蛋白的表达及其与核转录因子snail相关性的临床研究［J］.中国现代普通外科进展，2013，16（5）:362-365.

［3］A lfaras I，Perez M，Juan ME，et al.Involvement of Breast Cancer Resistance Protein（BCRP1/ABCG2）in the Bioavailability and Tissue Distribution of frans-Resveratrol in Knockout M ice［J］.J Agric Food Chem，2010，58（7）:4523-4528.

［4］Eisenhauer EA，Therasse P，Boqaerts J，et al.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline（version 1.1）［J］.Eur J Cancer，2009，45（2）:228-247.

［5］任杰，李遒昶，李晓蕾，等.乳腺癌CYPB1的表达对紫杉醇耐药性的影响［J］.中国肿瘤临床，2012，39（23）:1904-1908.

［6］Soliman AA，Csorba R，Ullrich A，et al.Antiphopholipid antibodies and functional activated protein C resistance in patients w ith breast cancer during anthracycline-based chemotherapy adm inistered through an intravenous port-catheter device［J］.Clin ApplThromb Hemost，2014，20（3）:338-340.

［7］张彦收，刘运江.乳腺癌组织中BCRP的表达与新辅助化疗疗效的关系［J］.肿瘤防治研究，2014，41（5）:434-438.

［8］王莉莉，于超.丹皮酚对HepG2细胞药物转运体BCRP及SLCO1B1表达及功能的影响［J］.中国生化药物杂志，2015，36（3）:6-9.

［9］Ginguene C，Champier J，Maallem S，et al.P-glycoprotein（ABCB1）and breast cancer resistance protein（ABCG2）localize in the microvessels forming the blood-tumor barrier in ependymomas［J］.Brain Pathol，2010，20（5）:926-935.

［10］齐彩霞.BCRP与P-gp在乳腺癌组织中的表达及其意义［J］.山西大同大学学报（自然科学版），2014，30（1）:52-54.

［11］汪林军，王腾，吴小红，等.血浆微泡乳腺癌耐药蛋白mRNA水平对乳腺癌化疗疗效的预测价值［J］.中华实验外科杂志，2015，32（5）:976-968.

［12］Mears R，Craven RA，Hanrahan S，et al.Proteom ic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry［J］.Proteom ics，2004，4（12）:4019-4031.

［13］Al-Nedaw i K，Meehan B，M icallef J，et al.Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRv III by m icrovesicles derived from tumour cells［J］.Nat Cell Biol，2008，10（5）:619-624.

［14］毕玮琳，王伏生，董红霖.survivin-siRNA联合化疗药物对乳腺癌MCF-7细胞凋亡及逆转耐药的研究［J］.肿瘤研究与临床，2014，26（5）:310-314.

［15］陈淑如，黄宇康，吴楚成，等.miR-155对乳腺癌细胞增殖、凋亡及耐药蛋白表达的调控作用研究［J］.临床肿瘤学杂志，2015，20（2）:108-111.

Clinical analysis of the BCRP mRNA level in plasma microvesicles of breast cancer patients△

TU'ERSUNJIANG Ai-li DILIXIA Si-mayi PAZILAITI A-budurexiti SIMAYILI Mai-maitiniyazi
1Department of Medicine，2Key Laboratory，M inistry of Education，3Department of Breast Radiation Oncology，Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang，830011，China

Objective To investigate the relationship between the breast cancer resistance protein（BCRP）mRNA level in plasma m icrovesicles and efficacy of chemotherapy，and related genes.Method 60 cases of breast cancer patients who were given neoadjuvant chemotherapy were included as breast cancer group，while another 60 cases of healthy adults were enrolled as control group.The BCRP mRNA level in plasma microvesicles and the level of apoptosis related breast cancer genes，such as caspase-3，caspase-9 and proliferation related genes，including Survivin，Bcl-2 were analyzed.Result The BCRP mRNA level in plasma microvesicles were higher in breast cancer group as compared w ith control group，w ith significant difference observed（t=31.289，P＜0.05）；While the levels in CR/PR patients were lower in that of SD/PD patients，which were significantly different（P＜0.05）；For apoptosis genes，the mRNA of caspase-3 and caspase-9 were less in breast cancer tissues than in the adjacent normal tissues，while for the proliferation related genes，the mRNA of Survivin and Bcl-2 were higher in breast cancer tissues than in the adjacent normal tissues，and all differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The mRNA level of BCRP in plasma m icrovesicles was negatively correlated w ith the mRNA levels of caspase-3 and caspase-9，while was positively correlated w ith the mRNA level of Survivin and Bcl-2.The BCRP mRNA level in plasma m icrovesicles is predictive for the efficacy of adjuvant chemotherapy in breast cancer，and is useful in guiding the chemotherapy for breast cancer.

breast cancer；chemotherapy；breast cancer resistance protein；proliferation；apoptosis

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.141233#

2015-12-08）

新疆医科大学科研创新基金（XJC201388）

（corresponding author），邮箱：497070959@qq.com