高效液相色谱-串联质谱法同时检测水中17种抗生素

2016-10-16李经纬丁紫荣余乐洹刘小燕王美欢任明忠

分析科学学报 2016年6期

李经纬，丁紫荣，余乐洹,3，刘小燕，王美欢，庄僖，任明忠*，刘珊

(1.长安大学，旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，陕西西安 710064；2.环境保护部华南环境科学研究所，广东广州 510655；3.广东第二师范学院，广东广州 510303)

近年来，随着抗生素生产量和使用量的迅猛增长，产生的药物残留及代谢产物持续不断的进入水体中，可能会在水环境中富集，使水中细菌抗药性增强，生物致畸突变，对人体健康和当地生态环境产生不可预测的危害[1,2]。目前已经从多种水环境中检出抗生素类药物[3 - 6]。由于抗生素在环境中分布复杂，含量很低，水环境中通常是ng/L～μg/L级的浓度水平。因此，抗生素类物质的检测方法不仅要有良好的抗干扰性，同时对于低浓度的检测还需要较强的灵敏性和量化性[7 - 10]。近几年高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)及气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)等新技术的开发与应用，更使精确定性定量环境中抗生素类药物变为可能[11 - 13]。但是这些方法大都是针对某几种或某一类化合物，不适用于复杂基质的分析检测。

在广东地区关于抗生素在水环境中检测分析的研究较多，如唐才明等[14]在海水和城市污水中检出多种磺胺和大环内酯类抗生素，海水中磺胺甲恶唑为16.5 ng/L，污水中磺胺类为29.2～468 ng/L；徐维海等[ 15]在珠江广州河段水体中检出氟喹诺酮和大环内酯类抗生素，其质量浓度分别为70.0～489 ng/L和13.0～69.0 ng/L。叶计朋等[ 16]在珠江三角洲主要水体深圳湾中检出磺胺类抗生素为23.0～248 ng/L，维港中检出氧氟沙星为10.0～16.0 ng/L。本文针对水环境中存在的大环内酯类、磺胺类、甲氧苄啶、四环素类、氟喹诺酮类五类17种抗生素类物质，建立了同时检测不同性质抗生素类药物的HPLC-MS/MS方法。为环境中抗生素类物质污染的特征研究提供一种快速、准确的测定方法。

1 实验部分

1.1 主要试剂与材料

罗红霉素(RTM)、脱水红霉素(ETM-H2O)、三乙酸朱桃霉素(ODM)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、甲氧苄啶(TMP)、氧四环素(OTC)、四环素(TC)、氯四环素(CTC)、强力霉素(DC)、诺氟沙星(NFX)、氧氟沙星(OFX)、环丙沙星(CFX)、洛美沙星(LFX)、恩氟沙星(EFX)五类17种抗生素标准品及7种内标物质13C-D3-红霉素(ETM-13C-D3)、D4-磺胺甲恶唑(SMX-D4)、磺胺甲嘧啶(SMR)、D3-甲氧苄啶(TMP-D3)、D4-赛本咪唑(TBD-D4)、磺基水杨酸甲氯环素(MC)、D8-环丙沙星(CFX-D8)，均购自上海安谱实验科技股份有限公司。将上述17种目标物及7种内标物标准品用甲醇溶解，配制成20 μg/mL的标准储备液，于-18 ℃避光保存。使用时用甲醇依次将17种标准储备液混合稀释成500 ng/mL的标准工作液，将7种内标混合稀释成500 ng/mL内标工作液。甲醇(上海霍尼韦尔贸易有限公司)；甲酸(北京迪马科技有限公司)；乙酸铵(上海西格玛奥德里奇有限公司)；H2SO4、HCl(衡阳凯信化工试剂有限公司)；Na2EDTA(分析纯，广州化学试剂厂)。实验用水为超纯水。

0.22 μm尼龙滤膜(广州国凌仪器有限公司)；0.45 μm、200 mm的玻璃纤维滤膜(上海昀冠生物科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Infinity快速液相色谱(美国，Agilent)-AB 4000Q trap串联三重四级杆质谱(美国，AB SCIEX)联用仪；12位防交叉污染固相萃取仪(美国，Supelco公司)；MGS-2200氮吹浓缩仪(日本，EYELA公司)；SCQ-1000C超声波清洗仪(上海声彦)；隔膜真空泵(天津津腾实验设备有限公司)。Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6mL,美国Waters公司)；C18柱(广州国凌仪器有限公司)；PEP柱(中国博纳艾杰尔公司)。

1.3 液相色谱和质谱条件

1.3.1色谱条件CORTECSTM C18柱(100×4.6 mm;2.7 μm)；流动相：A为2%甲酸+2 mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～6.0 min，10%～68%B；6～7.5 min，68%～95%B；7.5～7.6 min，95%～10%B，流速0.5 mL/min；进样体积10 μL；柱温：45 ℃。

1.3.2质谱条件电离方式：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；喷雾电压：5 500 V；多反应离子监测模式(MRM)检测；入口电压EP=10.00 V，碰撞室出口电压CXP=11 V；各化合物优化的保留时间、MRM离子对、碎裂电压、碰撞能量见表1。

1.4 样品采集与前处理

用1 L棕色玻璃瓶采集水样后，立即加入50 mL色谱纯甲醇助溶，用稀H2SO4将pH调至3.0，水样置于4 ℃冰盒中运回实验室冷库保存，并在48 h内进行前处理。水样过200 mm玻璃纤维滤膜后加入0.5 g Na2EDTA，再加入100 μL 500 ng/mL的7种混合内标工作液，使其浓度达到50 ng/L，混合均匀后静置30 min。依次用10 mL甲醇和超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱，最后加入2 mL稀HCl(pH=3.0)对柱子进行酸化。以10 mL/min 速度加载水样通过Oasis HLB柱。加载完毕后用10 mL超纯水清洗小柱，以去除Na2EDTA和与小柱结合疏松的杂质，然后在抽真空条件下，干燥1.5 h以去除残留的水分。最后用12 mL甲醇进行洗脱，洗脱液收集于15 mL具塞玻璃刻度离心管中。将洗脱液氮吹至近干，用1 mL甲醇定容后，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜后，贮存于棕色进样瓶中，在-18 ℃下保存待检。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验比较了乙腈和甲醇作为流动相的分离效果，结果发现使用乙腈作为流动相时，基线更为稳定。同时比较了1%～3%不同体积比的甲酸溶液作为流动相的效果，结果表明2%甲酸+2 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相时，灵敏度最高，分离效果最佳。实验最终选定2%甲酸+2 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈作为流动相，7 min内7种内标物及所对应的17种目标化合物得到良好的分离。

2.2 质谱条件的优化

将17种抗生素标准溶液分别进样，首先用全扫描模式找出分子离子峰，然后以分子离子峰为母离子，对其进行轰击以获得二次碎裂产生的子离子。将分子离子和2个响应适宜的子离子组成检测离子对，以MRM模式进行定性和定量分析，在此基础上重点优化对灵敏度影响较大的碰撞能量和碎裂电压，从而获得丰度和比例达到最高的特征离子。7种内标物及所对应的17种目标化合物优化质谱参数见表1。

表1 17种抗生素定性定量离子

Note:IS represents the internal standard; X corresponds to quantitative ion; Y corresponds to qualitative ion.

2.3 固相萃取条件的选择和优化

2.3.1固相萃取柱的选择实验对比研究了C18、PEP、Oasis HLB 3种固相萃取小柱对空白水样加标的萃取回收率。图1表明PEP小柱与Oasis HLB小柱对17种抗生素均具有良好的回收效果，但Oasis HLB小柱的回收效果(61.5%～125%)普遍优于PEP小柱回收效果(39.9%～122%)，NFX、OFX、CFX、EFX四种氟喹诺酮类的抗生素在Oasis HLB柱上回收明显高于PEP小柱，而C18小柱除对于这五种化合物的回收效果不好外，对RTM、SMZ、TC的回收效果亦不佳，可能是C18的填料对于这些化合物吸附性较强，难以洗脱或是这些物质极性较强而对其没有吸附效果，造成回收效果不理想。综上所述，最终选择Oasis HLB固相萃取小柱。

2.3.2洗脱溶剂的选择实验对比了丙酮、二氯甲烷、乙腈、甲醇四种溶剂的洗脱效果。结果表明，丙酮、二氯甲烷、乙腈、甲醇四种溶剂对五种磺胺类化合物(SMX、SPD、SDZ、SMZ、TMP)洗脱能力相当；丙酮、乙腈、甲醇三种溶剂对三种四环素类化合物(OTC、TC、CTC)洗脱能力也相差不大，回收率均大于80%；丙酮和乙腈对大环内酯类(RTM、ETM-H2O、ODM)和氟喹诺酮类(NFX、OFX、CFX、LFX、EFX)洗脱回收效果稍差，二氯甲烷对TSETM、ODM、OTC和五种氟喹诺酮类洗脱回收效果很差，有的几乎为零，反映出这些物质可能很难溶于二氯甲烷。大环内酯类回收率整体不高可能是在水相中溶解度较大，在固相中不易保留[17]。甲醇对17种抗生素的回收率都比较好，回收率范围为62.1%～124%。因此，实验选取甲醇作为洗脱溶剂。

2.3.3洗脱溶剂的用量选择提高洗脱剂体积有助于抗生素的洗脱，分别以8、10、12、14、16 mL甲醇为洗脱溶剂。实验发现，当甲醇洗脱体积大于12 mL后，回收率趋于平衡。因此确定洗脱溶液的最佳体积为12 mL。

2.4 精密度及回收率实验

2.4.1基质加标实验用超纯水进行空白基质加标回收实验，按照10、100 ng/L的质量浓度加标后进行前处理,每个浓度平行4份，1份空白对照。17种抗生素的回收率及相对标准偏差如表2所示。由表2可见，该方法有较好的重复性及准确性，符合环境中抗生素类物质分析的要求。

2.4.2线性关系与方法检测限配制目标物浓度为0.5、1、2.5、5、10、25、50、100和250 ng/mL的标准系列溶液，根据子离子定量分析，17种抗生素线性相关系数R2>0.990。方法的检测限以3倍信噪比(S/N=3)进行计算为0.01～2.50 ng/L(表2)。

表2 目标物的检测限、标准曲线、回收率及相对标准偏差(n=4)

2.5 实际样品测定

采用本文建立的方法对广州市某河流上、下游两段各采集6份水样进行测定，由表3可见，除ODM、CTC、LFX、EFX在上游段未检测出，在下游段微量检测出外，其余13种抗生素均有不同浓度的检出。其中，检出大环内酯类抗生素为3.39～32.5 ng/L,磺胺类抗生素为19.9～335 ng/L，四环素类抗生素的质量浓度为0～560 ng/L，氟喹诺酮抗生素0～151 ng/L。