卢 晨，王亚飞，张 捷，闫书芹，张 强



丝素蛋白微球的制备

卢 晨，王亚飞，张 捷，闫书芹，张 强*

（武汉纺织大学 纺织科学与工程学院，湖北 武汉 430073）

本文提供了一种快速有效制备微纳米级丝素（SF）微球的方法。利用异丙醇使SF大分子迅速的β折叠化，再利用低温冻-融技术使得SF大分子组装成微纳米级丝素微球。通过调控SF分子量控制的SF微球直径及其分布，扫描电镜表明SF微球基本呈球形；粒径分析结果显示，利用LiBr，90℃制备的丝素溶液较LiBr，60℃制备的丝素溶液成球直径减小45.1%，约50~100nm；红外表明SF微球大分子主要为β折叠结构。通过这种方法可以高速有效的制备粒径小且分布均匀的微纳米级微球，使得SF微球在载药方面更具有应用潜力。

丝素；微球；自组装；分子量

1 前言

蚕丝作为一种天然蛋白质纤维，具有优异的机械性能、良好的生物相容性、生物降解性等。与其他高分子材料相比，作为天然高分子材料蚕丝丝素蛋白来源于生物体，其氨基酸序列中携带的部分生物信息可被细胞识别；丝素蛋白是由蚕的绢丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度的蛋白质，不含细胞器，与人类之间无病原微生物交叉感染的风险，生物安全性得到可靠保障；可被生物降解，最终产物为氨基酸或寡肽，易被机体吸收；可被溶解、纯化后加工成多种形态的材料。基于上述优点，丝素蛋白已被用于化妆品和食品添加剂约三十年，在手术缝合线领域也有近百年的使用历史[1]。已开发的丝素蛋白创面保护膜具有良好的生物相容性[2]和促创面重建的活性，并改进了其可缝合性能[3]。在药物缓释和再生医学微纳载体领域，丝素蛋白微球与部分细胞、机体组织具有特殊的亲和性，能够将所载药物在靶区集中，从而实现对机体病灶的靶向治疗[4]，表现出了极大的应用潜力和市场前景。因此，丝素蛋白缓释微球制备、结构、性能和应用，已成为当前医药制剂和再生医学领域的研究热点和重点。

自组装是指具有纳米尺度的微粒子能够自发形成规则结构的过程。蛋白质和多肽等物质自组装主要是依靠氢键、静电相互作用力和疏水作用等次价键作用力来实现的。SHI 等[5]采用自组装的方法制备了平均直径为980 nm的丝素微球，先利用乙醇诱导形成纳米颗粒，再将其加入到聚乙烯醇（PVA） 溶液中，冷冻24 h，然后通过吸附作用装载药物。CHEN 等[6]将模型药物PTX）溶解在乙醇中，然后与丝素溶液混合，然后在-20 ℃的条件下冷冻24 h，通过自组装制备装载药物的丝素微球。CAO等[7]在使丝素蛋白溶液在乙醇和冷冻的协同作用下，自组装形成纳米级微球。朱等[8]人利用冷冻剪切自组装法，在不添加任何有毒化学交联剂的情况下制备了粒径为1-5 µm的丝素微球。黄等[9]利用丝素纳米微球作为模板，利用自组装和电场调控的方法获得了直径在10-2000 nm的碳酸钙微球，在整个微球制备的过程中没有添加任何的有毒的化学试剂，完全满足在化妆、涂料、载药材料等方面的要求。CHENG等[10]利用自组装法制备丝素微球，并将微球与氯仿溶液共同制备成微胶囊，该微胶囊尺寸可控，可渗透性好，是一种极具潜力的药物载体。王等[11]利用冷冻干燥法制备呈圆形、粒径在300-900 nm、载药率为4.5 %左右的丝素蛋白(SF)/重组人骨形成蛋白2 (rhBMP-2)缓释微球；研究表明当SF与交联剂比例、rhBMP-2与SF质量比均会对微球的粒径和载药率有一定的影响。吉等[12]利用自组装制备了粒径为210-320 nm，分散指数为0.17左右、呈圆形、包封率及载药质量分数分别可达40.27 %及1.22 %载有姜黄素的丝素蛋白微球，且研究表明随着丝素蛋白质量分数增加，载药微球粒径增大；而姜黄素初始质量浓度的增大，可使微球粒径略有减小。

自组装法制备微球生产工艺简单，反应条件温和、产量高、不引入有害溶剂，并可以实现亲水性或疏水性两种药物的负载，应用前景广泛，但是微球的尺寸及其分散性还有待优化。本研究着眼于充分利用自组装法制备丝素微球的优点，同时通过采取不同的方法制备丝素溶液获取不同分子量的丝素蛋白大分子，来实现平均粒径小且粒径分布宽度较窄、分散性较好的丝素微球的制备。

2 实验仪器和实验材料

2.1 实验仪器

电子天平、电磁炉、电热恒温鼓风干燥箱、磁力恒温搅拌器、循环水式真空泵、冰箱、透析袋、傅立叶变换红外光谱仪、扫描电子显微镜、粒径分析仪、冷冻干燥机、锥形瓶、烧杯、玻璃棒、纱布、磁力搅拌转子等。

2.2 实验材料和药品

蚕丝、异丙醇、溴化锂、氯化钙、乙醇、去离子水等。

3 丝素微球的制备

3.1 家蚕丝素纤维脱胶

将家蚕丝放入浓度为0.06%的碳酸钠溶液中以浴比1:50进行脱胶，在98~100℃的条件下处理三次，前两次用自来水脱胶30min，并清洗干净；第三次用去离子水脱胶45min，并用去离子水洗净。然后扯松在55℃烘箱里烘干得到的精炼蚕丝备用。

3.2 家蚕丝素纤维溶解

（1）将脱胶的丝素纤维按浴比1:4加入9 M的LiBr溶液中，于60士2 ℃条件下搅拌溶解2h得到丝素蛋白混合溶液。

（2）将脱胶的丝素纤维按浴比1:4加入9 M的LiBr水溶液中，于100士2 ℃条件下搅拌溶解2h得到丝素蛋白混合溶液。

（3）将脱胶的丝素纤维按浴比1:5加入氯化钙：乙醇：水摩尔比为1:2:8 的三元溶液中，于72士2 ℃条件下搅拌溶解1 h得到丝素蛋白混合溶液。

（4）将脱胶的丝素纤维按浴比1:5加入氯化钙：乙醇：水摩尔比为1:2:8 的三元溶液中，于100士2 ℃条件下搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液。

3.3 家蚕丝素溶液的透析

将溶解制备的家蚕丝素蛋白混合溶液分别装入透析袋中(截留分子量为8000~14000Da)，用去离子水透析4天，期间每2小时换一次水，以除去LiBr、CaCl2等杂质。经透析得到的家蚕丝素蛋白溶液经纱布过滤离心装入试剂瓶中保存于4℃冰箱中冷藏备用。

3.4 家蚕丝素溶液浓度测定

将3个铝金属表面皿编号放入105℃烘箱中1h，取出称重得到皿重W(g)，在表面皿内各用移液枪各取1ml的家蚕丝素蛋白溶液倒入后称重Wl(g)，放入烘箱4 h后取出称重，以后每隔20 min称重一次，直到重量不再变化时记下数据为W2(g)。依据式(1)计算得到家蚕丝素蛋白溶液的浓度C(％)；然后求取浓度平均值，即为所求丝素溶液质量百分数。

刚透析出来的家蚕丝素蛋白溶液的浓度约为4 wt％。

3.5 丝素蛋白微球的制备

将采取不同方法制备的新鲜丝素溶液稀释到1wt%备用。将异丙醇和稀释的新鲜制备的丝素溶液按照体积为1:5混合，在37℃条件下均匀搅拌5min，待冷却放入-20℃条件下冷冻24h，再取出在室温条件下解冻便可获得微球。

4 丝素微球性能的测试

4.1 扫描电镜丝素微球表面形态观察

利用扫面电镜对微球形态进行观察，并初步分析其直径大小。实验结果表明，在丝素溶液浓度相同、采取相同的丝素微制备方法的条件下，丝素微球的形态基本是呈球形，与此同时实验结果表明微球粒径与丝素溶液的制备方法有明显的关系。在相同的条件下，利用三元溶液在100℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球较利用三元溶液在72℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球粒径要小；与此同时，利用溴化锂溶液在90℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球较利用溴化锂溶液在60℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球粒径要小。由此表明，制备丝素溶液的条件相对比较烈，获取的丝素大分子的断裂程度会相对较高，获取的丝素大分子的相对分子质量可能较小，从而进一步影响微球的直径和直径分布。

图1 丝素微球的几种形态

其中：图1（a）是采用三元溶液在72℃条件下制备的浓度为1wt%的丝素溶液制备的丝素微球；图1（b）是采用三元溶液在100℃条件下制备的浓度为1wt%的丝素溶液制备的丝素微球；图1（c）是采用溴化锂溶液在60℃条件下制备的浓度为1wt%的丝素溶液制备的丝素微球；图1（d）是采用溴化锂溶液在90℃条件下制备的浓度为1wt%的丝素溶液制备的丝素微球。

4.2 粒径分析

利用SmileView软件分析，得到利用不同方法制备的丝素溶液所制备的丝素微球的平均粒径和粒径分布情况。

利用三元溶液在72℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球粒径在100~250nm之间，平均粒径为179.3nm；利用三元溶液在100℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球粒径在60~120nm之间，且粒径在80nm左右的微球占大部分，平均粒径为101.7nm；利用溴化锂溶液在60℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球粒径在100~300nm之间，且大部分粒径在150~200nm之间平均粒径为157.6nm；利用溴化锂溶液在90℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球粒径在50~100nm之间，且大部分粒径在70nm，平均粒径为86.5nm。结果表明，采用不同的方法制备的丝素溶液对最终形成的丝素微球的直径及其分布有着明显的关系。三元溶液在100℃条件制备的丝素溶液制备的丝素微球的粒径分布宽度和平均粒径大小较72℃明显要小；同样，溴化锂溶液在90℃条件制备的丝素溶液制备的丝素微球的粒径分布宽度和平均粒径大小较60℃明显要小。初步猜想为制备丝素溶液的条件的剧烈程度对获取的丝素的大分子的相对分子质量及其分布宽度有一定的影响，从而进一步控制所制备的丝素微球的粒径及其分布宽度。

图2 不同条件下制备的丝素溶液的平均粒径

4.3 红外分析

利用傅立叶红外光谱分析仪对微球内部结构进行分析。在丝素的红外吸收光谱上，SilkⅠ的吸收峰出现在1650～1655 cm-1(酰胺Ⅰ)，1525～1540 cm- 1(酰胺Ⅱ)，1266 cm- 1(酰胺Ⅲ)，669 cm- 1(酰胺Ⅴ)附近。SilkⅡ的吸收峰出现在1620～1635 cm- 1(酰胺Ⅰ)，1531 cm- 1(酰胺Ⅱ) ，1230～1235 cm- 1(酰胺Ⅲ )，695 cm- 1(酰胺Ⅴ ) 附近。无规卷曲的吸收峰出现在：1655～1660 cm- 1，1535～1545 cm- 1，1235 cm- 1，650 cm-1，而新鲜制备的丝素蛋白主要是不稳定的无规卷曲结构[12]。红外结果表明，无论是采取何种丝素溶液制备的丝素微球，其红外吸收峰值基本是一致的。均在1650cm- 1和1535cm- 1处出现明显的红外吸收峰。而其中1650cm-1是α-螺旋结构的特征吸收峰，1535cm- 1是β-折叠结构的特征吸收峰。这一结果表明，丝素微球中的丝素蛋白结构存在部分β折叠化，形成了稳定的β折叠结构；与此同时也存在相对亚稳定的α螺旋结构。

图3 丝素微球红外光谱

其中：图3（a）是溴化锂溶液在90℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球；图3（b）是三元溶液在100℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球；图3（c）是三元溶液在72℃条件下溶解的丝素溶液制的丝素微球；图3（d）是溴化锂溶液在60℃条件下溶解的丝素溶液制备的丝素微球。

5 结论

本文主要是通过采取利用不同的方法溶解的丝素溶液来制备丝素微球，探讨了各种丝素溶液对制备的丝素微球的粒径大小及其分布的影响。本文可以得出初步结论：采用相对较为剧烈的方式获取的丝素溶液制备的丝素微球可以使得制备的丝素微球粒径和粒径分布宽度都相对减小；并且实验表明，利用三元溶液在100℃条件下溶解的丝素溶液和利用溴化锂溶液在90℃条件下溶解的丝素溶液可以成功制备纳米级丝素微球，且微球的分布宽度较窄。采用这一方法可以快速有效的制备微纳米级丝素微球，这使得丝素蛋白微球在载药方面的应用更加具有前景。

[1] MOY R L, LEE A, ZALKA A. Commonly used suture materials in skin surgery[J]．Am Fam Physican，1991，44：2123-2128．

[2] 宁丽，薛淼，黄海宁，等．皮肤再生膜的生物相容性系列研究[J]．中国修复重建外科杂志，2000，14(1)：44-48．

[3] Han F，Liu S，Liu X，et al．Woven silk fabric-reinforced silk nanofibrous scaffolds for regenerating load-bearing softtissues [J]． Acta Biomater，2014，10：921-930．

[4] 高志贤，李小强．纳米生物医药[M]．北京：化学工业出版社，2007．

[5] SHI P，GOH J C H．Release and cellular acceptance of multiple drugs loaded silk fibroin particle [J]．International Journal of Pharmaceutics，2011，420(2)：282-289．

[6] CHEN M， SHAO Z， CHEN X． Paclitaxel-loaded silk fibroin nanospheres [J]． Journal of Biomedical Materials Research Part A，2012， 100(1)： 203-210．

[7] CAO Z B， CHEN X，SHAO Z Z．The preparation of regenerated silk fibroin microspheres [J]．Soft Matter，2007，3(7)：910-915．

[8] 朱良均，潘岳林，张梅萍，等．一种制备丝素微球的自主装方法：中国，103965310[P]．2014-8-6．

[9] 黄永利．一种碳酸钙微球的制备方法：中国，101844789[P]．2010-9-29．

[10]CHENG C，IAN T，OLIVER B．Stimuli-Responsive Capsules Prepared from Regenerated Silk Fibroin Microsphere [J]．Macromolecular Bioscience，2014，14(6)：807-816．

[11]王春增，陈亮，顾勇．丝素蛋白/骨形成蛋白2微球制备及其活性研究[J]．中华实验外科杂志，2014，(7)：1419-1421．

[12]YongCheng Liu，Jianchong Qian，et al． Blend membrane of regenerated silk fibroin，poly(vinylalcohol)， and peroxidase and its application to a ferrocene mediating hydrogen peroxide secsor[J]．Journal of Applied Polymer Science， 1996，61：641-647．

The Preparation of Silk Fibroin Microsopheres

LU Chen, WANG Ya-fei, ZHANG Jie, YAN Shu-qin, ZHANG Qiang

(School of Textiles Science and Engineering, Wuhan Textile University,Wuhan Hubei 430073, China )

In this study, a quickly and effectively method to prepare well dispersivity micro-sopheres has been reported. The isopropyl alcohol has been used to process the fresh silk fibroin solution which can induce the formation of β-sheets from random coil structure quickly, then the process of freezing has been used to lead the self-assembly of the β-sheets silk fibroin macromolecules. The size and dispersvity of silk fibroin micro-spheres diameter were controlled through different methods of preparing silk fibroin solution which would result in different molecular weight of silk fibroin macromolecules. The surface features were determined by Scanning Electron Microscopy(SEM), the result indicated that the silk fibrion micro-sopheres is spherical; The size and dispersvity of silk fibroin micro-spheres diameter were determined by Smile View,the result suggested that the diameter of silk fibroin micro-spheres prepared from the silk fibrion solution which were prepared in LiBr solution at 90 ºC decresed by 45.1% compared to at 60 ºC; the molecule structure of silk fibroin microsphere were determined by Infrared Spectroscopy(FTIR ),the result suggested that the structure of silk fobroin molecule of micro-sopheres has changed to β-fold sheet or α-helix structure. In this way, the micro and nano sopheres can be prepared quickly and effectively which will largely broaden the application of silk fibroin sopheres.

silk fibroin; micro-sophere；self-assembly；molecular weight

TS201.1

A

2095－414X(2016)06－0003－05

张强（1982-），男，副教授，研究方向：纺织材料.

国家自然科学基金项目（51303141；51403163），湖北省教育厅重点项目（N154004）