李林洁， 何　燕， 单可人， 官志忠， 杨　明

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳　550004； 2.贵阳市妇幼保健院 优生遗传科， 贵州 贵阳　550001)



·专题研究2·

贵州布依族、侗族、苗族TTTY5、TSPY1、TSPY4基因拷贝数多态分析*

李林洁1,2， 何燕1**， 单可人1， 官志忠1， 杨明1

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳550004； 2.贵阳市妇幼保健院 优生遗传科， 贵州 贵阳550001)

目的： 研究贵州省布依族、侗族及苗族人群Y染色体的睾丸特异转录基因(TTTY5)、Y染色体睾丸特异编码蛋白1(TSPY1)和Y染色体睾丸特异编码蛋白4(TSPY4)基因的拷贝数多态性。方法： 采集292例男性少数民族(布依族、侗族、苗族)血液，通过实时荧光定量PCR法检测TTTY5、TSPY1及TSPY4基因的相对拷贝数，观察TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷贝数在布依族、侗族及苗族人群中的分布。结果： 在贵州布依族、侗族、苗族的292人中，TTTY5、TSPY1及TSPY4拷贝数分布范围分别为1～39拷贝、1～68拷贝及1～39拷贝；除苗族和侗族的TTTY5拷贝数外，TTTY5、TSPY1及TSPY4拷贝数在贵州布依族、侗族、苗族间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷贝数在贵州布依族、侗族、苗族人群中分布不一，各民族均有各自的拷贝数分布特点。

少数民族； Y染色体； 睾丸； 基因； 拷贝数多态； 贵州

Y染色体是唯一的父系遗传染色体，大约95%的Y染色体区域为非重组区域(nonrecombining region of Y chromosome, NRY)，该区域不与同源染色体发生重组，在传代的过程中不受重组的干扰，使得Y染色体上的遗传标记能够准确、清晰地追溯人类群体的人群分化和迁徙[1]。2004年，Iafrate[2]和 Sebat[3]先后报道了在人类基因组中存在拷贝数变异(copy number variants, CNV)，即基因组中≥1 000 bp的DNA片段因插入、缺失和/或扩增及其相互组合衍生出的复杂染色体结构变异，当CNVs在人群中的频率>1%，则称为拷贝数多态(copy number polymorphism, CNP)，CNP在进化和环境适应以及常见疾病的潜在易感性的研究中扮演了重要的角色[4-9]。贵州是一个多民族省份，境内17个世居少数民族大多在偏远地区聚族而居，由于民族间较少通婚且生活环境相对封闭，形成了遗传性上相对隔离的人群[10-11]。近年来，通过对不同人群的Y染色体序列的分析，许多人群特异的单体型已得到确定，而作为继SNP后的新一代遗传标记CNP，在贵州省少数民族遗传多态性研究中尚未报道。本文对贵州省布依族、侗族、苗族少数民族人群Y染色体上睾丸特异转录基因(testis-specific transcript，TTTY5)、Y染色体睾丸特异编码蛋白1(testis-specific protein Y-encoded 1，TSPY1)和Y染色体睾丸特异编码蛋白4(testis-specific protein Y-encoded 4，TSPY4)基因拷贝数的遗传多态性进行了调查研究，报道如下。

1　材料和方法

1.1标本采集及DNA提取

根据知情同意、随机抽样原则，选取贵州省境内3个世居少数民族——布依族、侗族、苗族男性292例，16～56岁，所选对象间无直系亲缘关系，292例血液标本的民族及采集地区分布见表1。所有被选者于清晨抽取外周静脉血5 mL，EDTA·Na2抗凝-80 ℃保存。采用酚-氯仿法抽提总DNA，并将样品DNA统一标化为100 mg/L作为模板，-20 ℃备用。

1.2TTTY、5TSPY1及TSPY4基因的相对拷贝数

1.2.1探针及引物序列和循环条件运用ABI 公司TaqMan Copy Number Assays试剂盒在ABI StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪上检测，以编码核糖核酸酶P(RNase P)基因为内参基因，RNase P基因在二倍体生物中为2拷贝。待测基因Taqman探针序列：TTTY5为5′-FAM-GGAGGATAGGAAGCAAGGCACATAA-3′，TSPY1为5′-FAM-ATGTTGTTCTTTC GGAGTAACCC-3′，TSPY4为5′- FAM-AACCCCTACTTCCAGAATAAAG-3′。TTTY5基因的探针及引物为ABI公司预设计产品，TSPY1、TSPY4的探针及引物序列根据基因序列设计送ABI公司合成，Mix预混液为ABI公司TaqMan Copy Number Assays试剂盒提供。采用多重PCR在同一反应体系中同时扩增目的基因与内参RNaseP基因，循环条件为95℃ 10 min，95 ℃ 15 sec、60 ℃ 60 sec，40个循环。

表1　292例血液标本的民族及采集地区分布

1.2.2标准曲线及结果判定将对照DNA样本按5倍浓度梯度稀释成系列标准品，ABI StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪采集各标准品基因与内参RNase P基因扩增线性情况，得出各目的基因标准品标准曲线，RNaseP标准曲线为Y=1.63x+29.07,R2=0.988；TTTY5标准曲线为Y=1.69x+29.44,R2=0.995；TSPY1标准曲线为Y=1.68x+25.12,R2=0.999；TSPY4标准曲线为Y=1.6817x+25.124,R2=0.999。参照文献[12]目的基因和参照基因的PCR扩增效率比值>95%，可通过相对定量法计算基因的相对拷贝数，以ABI StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪附带软件Step-one 2.1进行荧光收集和CT值分析。

1.3统计学方法

2　结果

2.1TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷贝数的分布

292例布依族、侗族及苗族男性样本中，TTTY5拷贝数变异分布范围为1～39拷贝，其中布依族为1～34拷贝、侗族为2～39拷贝、苗族为6～36拷贝；TSPY1基因拷贝数变异分布范围为1～68拷贝，其中布依族为9～29拷贝、侗族为6～68拷贝、苗族为1～3拷贝；TSPY4基因拷贝数变异范围为1～39拷贝，其中布依族为19～39拷贝、侗族为1～7拷贝、苗族为1～2拷贝。见图1。

图1　TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷贝数在布依族、侗族及苗族的分布Fig.1　The frequency distribution of TTTY5, TSPY1 and TSPY4 copy number

2.23个民族的TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷贝数

TTTY5基因拷贝数从高到低依次为苗族、侗族及布依族，苗族、侗族与布依族比较，差异有统计学意义(P<0.01)，侗族与苗族比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TSPY1基因拷贝数从高到低依次为侗族、布依族及苗族，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。TSPY4基因拷贝数从高到低依次为布依族、侗族及苗族，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2　布依族、侗族及苗族人群中TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷贝数

(1)与布依族比较，P<0.01，(2)与侗族比较P<0.01

3　讨论

Y染色体是人类仅有的单倍遗传的染色体，除了两臂末端26 000 bp的拟常染色体区外，其余大约95%的区域都为Y染色体非重组区域，该区域的DNA序列忠实记录着发生在祖先的突变。CNVs作为一类基因组变异，发生变异的基因组节段占整个人类基因组的12%，覆盖人类基因组中13%的基因及5%以上的编码序列，是疾病发生的重要遗传学基础[13-14]。目前的研究认为，CNPs具有与SNPs相似程度的人群差异，即不同人群之间可能共享大部分相同的CNPs，而部分CNPs在不同人群中以不同频率分离并有显著性差异[15]。TTTY5基因位于Yq11.223，长度为2 079 bp，该基因由DGV于2005年收录，所在的变异ID号为0833，该基因的拷贝数变异类型为拷贝数的缺失。有研究报道Y染色体AZF区域上在睾丸中转录的基因家族的缺失，是造成男性生精障碍的原因之一，而TTTY5和TTTY6、RBMY1、PRY的复杂回文结构的基因家族可能涉及到由AZFc区域缺失引起的生精障碍[16]。TSPY1和TSPY4基因为编码睾丸特异蛋白基因，伴Y染色体遗传，位于Y染色体短臂。TSPY1是蛋白超家族中的一员，包含有周期蛋白B的结合域，通过与周期蛋白B共同激活复制进程中的因子，在男性减数分裂中扮演了重要的角色[17]。

本研究结果显示，来自不同地区的布依族、侗族及苗族的TTTY5、TSPY1及TSPY4拷贝数差异有统计学意义(苗族和侗族间的TTTY5拷贝数差异除外)，其中，TTTY5基因拷贝数在苗族人群中最高，布依族最低；TSPY1基因拷贝数在侗族人群中最高，苗族最低；TSPY4基因拷贝数在布依族人群中最高，苗族最低，提示这3个少数民族各为遗传关系相对独立的群体。本研究中的苗族样本的结果显示，来自贵州3个地区的雍里苗族、沙井苗族及威宁苗族样本的TSPY1、TSPY4基因拷贝数均<5拷贝，明显低于布依族和侗族，提示这3个苗族群体虽然聚居地区不同，但相同民族间遗传关系却很接近。证实了贵州苗族虽然在历史的长河里不断发生大幅迁徙和局部迁徙、分布零散、与兄弟民族交错杂居，但贵州各地苗族可能属一脉相承，封闭的地理环境和婚嫁习俗使得Y染色体特有的遗传特征得到很好的保留。TTTY5、TSPY1及TSPY4基因拷贝数在本次研究的布依族、侗族和苗族中呈现出不同的特点。TTTY5拷贝数在苗族人群中无<5拷贝分布，这与拷贝数以<5频率较高的布依族、侗族形成了较大的反差。布依族、侗族起源于百越系统，苗族出自古代苗瑶族系，在本课题组的前期Y-SNP研究中发现，贵州百越系统中的民族有密切联系，且与国内其他地域百越系统有较大的遗传差异，为较独立的一个群体[10]。本次拷贝数多态研结果也体现了布依族、侗族相较于苗族有其独特性。TSPY4拷贝数结果中，苗族拷贝数最低，布依族最高；2个布依族人群的拷贝数分布均处于相同的几个区域内，不同地区的侗族、苗族人群各自的拷贝数分布范围也基本一致，提示3个民族拥有各自独特的遗传特点，且分布于不同地域的同一民族遗传背景接近。

综上，本次研究结果表明，在贵州多个地区的布依族、侗族、苗族男性人群中TTTY5、TSPY1、TSPY4拷贝数分布不一，但各民族均有各自的拷贝数分布特点。

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(2016-05-21收稿，2016-08-22修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Analysis of Gene Copy Number Polymorphism forTTTY5,TSPY1 andTSPY4 in Buyi, Dong and Miao Nationality of Guizhou Province

LI Linjie1,2, HE Yan1, SHAN Keren1, GUAN Zhizhong1, YANG Ming1

(1.TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofBirthHealthGenetic,MaternityandChildrenHealthHospitalofGuiyang,Guiyang550001,Guizhou,China)

Objective: To investigate gene copy number polymorphism of testis-specific gene transcript of Y chromosome (TTTY5), testis-specific protein Y-encoded 1 (TSPY1) and testis-specific protein Y-encoded 4 (TSPY4) in Buyi Nationality, Dong nationality and Miao nationality of Guizhou Province. Methods: The blood of 292 cases of male ethnic minorities (Buyi, Dong, Miao) was collected. Real-time fluorescent quantitative PCR was adopted to detect relative copy number ofTTTY5,TSPY1 andTSPY4 genes. Distribution and difference of copy number ofTTTY5,TSPY1 andTSPY4 genes were observed in Buyi, Dong and Miao nationalities. Results: In total 292 cases, the copy number range ofTTTY5,TSYP1 andTSPY4 gene were 1～39 copies, 1～68 copies and 1～39 copies in Buyi, Dong and Miao nationalities, respectively. Except forTTTY5 gene copy numbers of Miao and Dong nationality, there were statistically significant differences in the distribution of copy numbers among Buyi, Dong and Miao nationality (P<0.01).Conclusions：TTTY5,TSPY1 andTSPY4 gene copy number distribution is not consistent in Buyi, Dong and Miao nationality of Guizhou Province, and each nationality has its own copy number distribution characteristics.

ethnic group; Y chromosome; testis; gene； copy number polymorphism; Guizhou province

国家自然科学基金项目(No.31560306)； 贵州省社会发展科技攻关项目[黔科合SY(2012)3135号]; 贵州省“2011协同创新中心”[黔教合协同创新中心(2014)06号]

E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn

R394; RZ273

A

1000-2707(2016)09-1006-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.004

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网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.028.html