肖　源， 车筑平， 程　华， 杨红静， 谭庆华

(1.贵州医科大学第三附属医院 消化内科， 贵州 都匀　558000； 2.贵州医科大学附院 内镜中心， 贵州 贵阳　550004； 3.贵州医科大学 临床医学院， 贵州 贵阳　550004； 4.四川大学华西医院 消化内科， 四川 成都　610041)



NSAIDs肠病大鼠回肠SIgA、IL-1β、IL-8、IL-10水平及树突状细胞数的变化*

肖源1， 车筑平2， 程华1， 杨红静3， 谭庆华4**

(1.贵州医科大学第三附属医院 消化内科， 贵州 都匀558000； 2.贵州医科大学附院 内镜中心， 贵州 贵阳550004； 3.贵州医科大学 临床医学院， 贵州 贵阳550004； 4.四川大学华西医院 消化内科， 四川 成都610041)

目的： 探讨非甾体类消炎药(NSAIDs)肠病时SD大鼠回肠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-8、IL-10水平及树突状细胞数的变化。方法: 34只清洁级SD大鼠均分为药物损伤模型组(模型组)和对照组，模型组大鼠腹腔注射阿司匹林(100 mg/kg，2次/d)，对照组腹腔注射等量生理盐水；造模2周后处死大鼠，在距回盲瓣5 cm近端肠管切取回肠段2 cm，采用ELISA法检测大鼠回肠黏膜组织SIgA、IL-1β、IL-8及IL-10水平，免疫组织化学(IHC)检测回肠黏膜CD205阳性染色的树突状细胞数量。结果： HE染色结果显示，模型组黏膜上皮细胞破坏，黏膜杯状细胞减少，隐窝结构变形，固有腺体排列紊乱，黏膜以及黏膜下层见大量淋巴细胞以及单核细胞；对照组黏膜正常，未被破坏；免疫组织化学染色后，与对照组比较，模型组大鼠CD205阳性细胞增多，IOD值升高(P<0.05)；模型组大鼠回肠黏膜SIgA降低(P<0.05),IL-1β、IL-8及IL-10增加，树突状细胞数量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论： NSAIDs肠病发生后，回肠黏膜保护屏障受损，体液免疫紊乱。

树突状细胞； 分泌型免疫球蛋白A； 白细胞介素； 非甾体类消炎药肠病； 大鼠,Sprague-Dawley

随着非甾体类抗炎药(NSAIDs)的广泛使用， NSAIDs肠病成为其主要的副作用之一。NSAIDs肠病是一种以肠道蛋白丢失、肠道出血、肠黏膜炎症及通透性改变、回肠吸收障碍为临床表现的非特异性肠炎[1]。目前，NSAIDs对胃部损害的发病机制现已阐明，但对于肠道黏膜的损伤机制，多数学者认为是局部及系统免疫共同作用的结果[2-3]。以CD205为代表的树突状细胞是肠道内重要的抗原递呈细胞，是肠道免疫的重要参与者[4]。T细胞被激活之后通过分泌白细胞介素-10(IL-10)等抑制性细胞因子，发挥免疫抑制，维持肠道免疫稳态；另外T细胞还可以通过分泌IL-1、IL-6及IL-8等促炎因子，释放炎性介质介导强烈的炎症反应。肠道免疫中的体液免疫的主要参与者为分泌型免疫球蛋白A(SIgA)，SIgA是肠道黏膜屏障的第一道屏障，它的削弱，将导致肠道黏膜屏障功能减弱，引起肠道免疫平衡失调，肠道细菌移位，蛋白丢失等反应，导致肠道炎症的发生[5]。因此，为探讨NSAIDs对肠道黏膜的损伤机制，本研究通过观察大鼠NSAIDs肠病模型中IL-1β、IL-8、IL-10、SIgA水平及树突状细胞数(CD205)，了解NSAIDs时大鼠肠黏膜免疫功能的变化。

1　材料与方法

1.1动物及分组

清洁级SD大鼠34只(购于贵州医科大学实验动物中心)，雌雄各半，8周龄，体质量(210±10)g，饲养温度(23±2)℃，采用自然光，分笼饲养，自由饮食。采用随机数字表法将大鼠均分为药物损伤组(模型组)和对照组，模型组大鼠腹腔注射100 mg/kg精氨酸阿司匹林注射液(海南灵康制药有限公司，130401，海南，中国)，对照组大鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水，2次/d，连续2周。

1.2方法

1.2.1取材两组大鼠禁食24 h，禁饮8 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100 g)麻醉，打开腹腔，距回盲瓣近端5 cm处向近端切取回肠段2 cm，用PBS冲净肠内容物。肠管组织均分为2份，一份按1∶5的比例加入PBS液，低温下制备组织匀浆，以3 000 r/min离心20 min，取上清液测定SIgA、IL-1β、IL-8、IL-10水平；另一份放入10%中性福尔马林固定，制作石蜡切片，用于HE及免疫组化学染色。通过HE染色观察大鼠肠道黏膜损伤情况。

1.2.2IL-1β、IL-8、IL-10、SIgA水平及CD205染色阳性树突状细胞数采用ELISA法测定SIgA(Rat secretory immunoglobulin A SIgA ELISA Kit，批号E-30311，美国rndsystems公司)、IL-1β、IL-8及IL-10水平(试剂盒购于北京永辉，编号E-30418、E-30581、E-30581)，严格按ELISA试剂盒说明书操作。采用免疫组织化学(IHC)染色测定CD205(Rabbit Anti-CD205，编号bs-2565R，北京博奥森生物技术有限公司)，一抗-4 ℃过夜23 h，DAB显色剂染色，显色时间1～2 min，苏木素复染后，脱水、透明，中性树胶封片，观察染色阳性的细胞。采用Image Proplus 6.0图像分析软件进行半定量分析，计算出阳性细胞IOD值。

1.3统计学处理

2　结果

2.1HE和IHC染色

HE染色结果显示(图1A、B)，模型组黏膜上皮细胞破坏，黏膜杯状细胞减少，隐窝结构变形，固有腺体排列紊乱，黏膜以及黏膜下层见大量淋巴细胞以及单核细胞；对照组黏膜正常，未被破坏。IHC染色后，模型组大鼠CD205阳性细胞增多，与对照组比较，观察组IOD值升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1C、D。

注：A、C对照组，B、D为模型组；A、B为HE染色，CD为IHC染色；箭头所指为CD205阳性细胞图1　大鼠回肠组织HE和IHC染色(400×)Fig.1　Immunohistochemical staining of rat intestinal mucosa

2.2IL-1β、IL-8、IL-10及SIgA水平

ELISA结果显示，与对照组比较，模型组肠黏膜IL-1β、IL-8及IL-10含量明显增多，SIgA含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　两组大鼠回肠黏膜CD205 IOD值、IL-1β、IL-8、IL-10及SIgA水平

(1)与对照组比较，P<0.05

3　讨论

随着人口老龄化的进展，NSAIDs引起消化道损伤备受大家关注，目前，NSAIDs引起肠道黏膜损伤机制仍不清楚，有研究表明NSAIDs引起肠道黏膜损害，黏膜通透性增加是其发病的主要因素之一，肠道黏膜免疫是其发病因素的重要组成部分[6]。本研究通过比较模型组以及对照组SD大鼠肠黏膜免疫功能的变化发现，当发生NSAIDs肠病时， CD205表达增强，提示肠道免疫反应的增强，树突状细胞染色增加不仅表现在肠黏膜淋巴结内，上皮细胞也明显增多、增强，说明树突状细胞细胞可能直接和间接发挥递呈抗原的作用都在增强，但局部肠道免疫是否相应增加，还要看效应细胞的反应情况[7]。IL-8是一种很重要的炎症趋化因子，对中性粒细胞、T淋巴细胞的趋化作用，可诱导它们局部释放炎性介质引起炎性反应，从而导致肠上皮细胞变性、坏死、脱落并广泛损害[8]。IL-10是肠道内重要的抑炎因子，是下调肠道免疫反应的炎症因子， IL-1、IL-8的释放，可减轻或者削弱肠道炎症的发生[9-10]。本实验证实，NSAIDs肠病时，模型组肠黏膜中IL-1β、IL-8、IL-10水平高于对照组，说明NSAIDs肠病发生，IL1-β、IL-8等促炎因子参与了疾病的进程，随着病程进展，免疫平衡被打乱，抑炎因子也释放，力求维持肠道内免疫平衡，可见在NSAIDs肠病时，细胞免疫参与了肠道免疫的过程。SIgA的产生开始于小肠集合淋巴结， B细胞中活化的浆细胞可以分泌IgA， SIgA释放如肠腔，可以与相应的抗原结合，抑制病原体以及细菌的增殖、中和毒素，清除食物蛋白抗原，又可以抵抗蛋白溶解酶的作用，抵御肠道黏膜被其破坏，进而保护肠道黏膜的完整性，是肠道黏膜屏障的重要组成部分，在维持肠道微生态平衡中起着决定性作用[11-13]。在本研究中，大鼠NSAIDs肠病发生后肠道内SIgA含量低于对照组(P<0.05)，表明SIgA在NSAIDs肠病时肠黏膜中的含量降低，SIgA的合成、分泌减少，获得性体液免疫受到损害。同时肠道黏膜免疫屏障功能失调，抵御肠腔内病毒、细菌及中和肠道毒素的功能减弱，肠腔内抗原物质与效应细胞接触引起局部炎症细胞分泌多种细胞因子如IL-1、IL-8，进一步加重了肠道炎症。

综上 ，NSAIDs肠病发生后，树突状细胞数量增多，提示肠道免疫反应启动。IL-1β、IL-8及IL-10增多，表明肠道内炎症因子增多，促炎因子增加，细胞免疫平衡紊乱，肠道黏膜内SIgA分泌明显较少，回肠黏膜保护屏障受损，体液免疫紊乱。

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(2016-06-25收稿，2016-08-28修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵毅

Changs of SIgA,IL-1β、IL-8、IL-10 Levels and Dendritic Cells in Intestinal Mucosa of Rats with NSAIDs Enteropathy

XIAO Yuan1, CHE Zhuping2, CHENG Hua1, YANG Hongjing3，TAN Qinghua4

(1.DepartmentofDigestiveSystem,ThirdAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China;2.DigestiveEndoscopyCenter,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofClinicalMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.DepartmentofDigestiveSystem,WestChinaHospitalUniversity,Chengdu610041,Sichuan,China)

Objective: To investigate the changes of non-steroidal anti-inflammatory drug enteropathy in SD rats with ileal SIgA, interleukin-Iβ, interleukin-8, interleukin-10 and dendritic cells change. Methods: 34 SPF grade Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups in equal number. The aspirin group received intraperitoneally injections of 100 mg/kg of aspirin twice a day for 14 days, the control group received equal volume of normal saline. 5 cm from the ileocecal valve in the proximal intestine was cut off by 2 cm after constructing the model for 2 weeks and executed the rats. The levels of SIgA, IL-1β, IL-8 and IL-10 in ileal tissue were detected by ELISA. The quantity of CD205-positive cells in mucosa was tested by immunohistochemistry analysis. Results: Aspirin group compared with control group, the level of SIgA in ileal tissue of aspirin group decreased (P<0.05)，IL-1β, IL-8, IL-10 and the number of dendritic cells increased (P<0.05); mucosa of control group was normal and stayed intact; after IHC staining, CD205 positive cells increased in model rats, comparing with control group, observation showed increased IOD value(P<0.05); comparing with control group, SIgA in model group rats ileal mucosa decreased(P<0.05), IL-1β, IL-8 and IL-10 increased, dendritic cells increased (P<0.05). Conclusion：NSAIDs bowel disease would damage intestinal mucosal barrier and caused thumoral immune disorder.

dendritic cell； secretory immunoglobulin A; Interleukin; non steroidal anti-inflammatory drug enteropathy; rats, Sprague-Dawley

贵州省科技厅基金(E2011-10)

E-mail:tanqh2007@163.com

R574

A

1000-2707(2016)09-1064-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.017

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网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.040.html