孙海柏,张丽霞,王　潇,刘佳庆,刘　雅,曹　宏

(天津市海河医院检验科　300350)



·临床研究·

T-SPOT及肺泡灌洗液T细胞亚群检测在肺结核及肺结节病鉴别诊断中的意义

孙海柏,张丽霞,王潇,刘佳庆,刘雅,曹宏

(天津市海河医院检验科300350)

目的探讨结核分枝杆菌T细胞斑点试验(T-SPOT)及肺泡灌洗液T细胞亚群检测在肺结节病和肺结核鉴别诊断中的作用。方法选择2010年1月至2015年9月该院确诊的50例肺结节病和123例肺结核患者进行T-SPOT和肺泡灌洗液T细胞亚群检测，并对结果进行统计和分析。结果肺结节病患者中T-SPOT阳性率为4.0%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T细胞百分比分别为(88.79±5.34)、(63.58±20.56)、(27.42±6.76)%，CD4+/CD8+比值为2.32±2.0；肺结核患者中T-SPOT阳性率为90.2%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T细胞百分比分别为(75.10±11.20)、(44.52±7.30)、(32.10±12.30)%，CD4+/CD8+比值为1.30±1.20。肺结节病患者较肺结核患者CD3+和CD4+T细胞明显增多,CD4/CD8比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)，CD8+T细胞有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05)；肺结核患者T-SPOT阳性率明显高于肺结节病患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论T-SPOT以及肺泡灌洗液T细胞检测适用于快速鉴别诊断肺结节病与肺结核。

结核分枝杆菌T细胞斑点试验；T细胞亚群；肺结节病；肺结核

肺结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵入许多脏器，以肺部结核感染最为常见，排菌者为其重要的传染源。结节病是一种病因不明的以非干酪样坏死性肉芽肿性病变为病理特征的疾病，可累及全身多系统器官受累，临床表现多样,缺乏特异性,易造成漏诊和误诊。目前常用的结节病实验室诊断方法有支气管肺泡灌洗液检查、组织病理学检查等，因其与结核病有许多相似之处且常被误诊为结核病，并按照结核病治疗方案进行治疗[1]。本文对临床确诊的50例肺结节病患者以及123例肺结核确诊患者的结核分枝杆菌T细胞斑点试验(T-SPOT)结果与肺泡灌洗液中T细胞亚群结果进行比较分析，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选择本院2010年1月至2015年9月收治的123例肺结核患者及50例临床确诊的肺结节病患者为研究对象，其中男112例、女61例，年龄35～78岁。肺结核确诊患者诊治前有低热(午后为主)、盗汗、乏力、食欲缺乏、消瘦、女性月经失调等症状，呼吸道有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难等症状，影像学检查显示胸部有阴影，结核菌培养阳性。肺结节病患者均经临床特征、影像学检查、病理活检确诊，符合肺结节病诊断标准[2]。

1.2方法

1.2.1T-SPOT试剂为英国Oxford Immunotec公司生产的结核感染T细胞检测试剂(T-SPOT.TB),采用酶联免疫斑点试验在已包被抗γ-干扰素抗体微量板的4个孔中，分别加入50 μL AIM细胞培养液作为阴性对照，50 μL植物血凝素作为阳性对照，50 μL结核分枝杆菌特异混合多肽A(ESAT-6抗原)作为测试孔A，50 μL结核分枝杆菌特异混合多肽B(CFP-10抗原)作为测试孔B，然后在每个孔中加人含250 000个细胞的上述悬液。把微量板放入37 ℃ 5%CO2培养箱培养16～20 h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗板4次，加入50 μL新鲜配制的碱性磷酸酶标记的小鼠抗γ-干扰素单克隆抗体，将培养板在2～8 ℃孵育1 h。孵育后用PBS洗板4次。最后每孔加入底物工作液50 μL，室温反应7 min。以蒸馏水冲洗终止反应，在干燥培养板中37 ℃ 2～3 h或室温过夜，计数斑点形成细胞(SFCs)。根据抗原A和/或抗原B孔的反应判断结果:(1)如果阴性对照孔SFCs为0～5，抗原A和/或抗原B孔SFCs减去阴性对照孔SFCs≥6视为阳性;(2)当阴性对照孔SFCs≥6，抗原A和/或抗原B孔SFCs≥2倍阴性对照孔SFCs视为阳性[3]。

1.2.2肺泡灌洗液T细胞亚群检测采用美国BD公司FACSCanⅡ流式细胞仪进行检测,CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP三色荧光抗体及同型对照、红细胞裂解液购自BD公司。(1)肺泡灌洗液样品的制备。新鲜肺泡灌洗液经尼龙布滤除杂质和痰液,离心洗涤2次,计数并调节细胞数为每管(2～10)×106/mL,加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP荧光抗体室温避光孵育20 min,加10%配制的红细胞裂解液2 mL避光10 min,300 r/min离心5 min,弃上清液,加PBS 2 mL离心洗涤,用0.5 mL PBS重悬细胞。同时以另一管做同型对照。(2)流式细胞仪测定。以荧光微球7-colour校准仪器光路使其分辨率达到最佳工作状态,采用Canto软件获取与分析数据。调节电压、阈值、补偿使细胞在图中分布于合适的位置,在FSC/SSC图中圈出淋巴细胞群为R1,SSC/CD3图中以CD3+细胞群圈门(R2)以排除巨噬细胞、碎片及其他成分的干扰,建立CD4/CD3、CD8/CD3散点图并设置为显示G3=R1×R2门内的细胞,获取细胞总数10 000个,根据同型对照设十字门分析Th(CD3+CD4+)和Ts(CD3+CD8+)细胞的表达情况,同时计算出CD4+/CD8+比值。

2　结　　果

2.1两组患者T-SPOT结果比较肺结核组的阳性率为90.2%，肺结节组阳性率为4.0%，肺结核组患者的阳性率明显高于肺结节病组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　　两组患者T-SPOT结果比较(n)

2.2两组患者T细胞亚群结果比较肺结节病组患者较肺结核组CD3+和CD4+T细胞明显增多,CD4/CD8比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)，CD8+T细胞有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3两种方法检测结果分析同时比较两组患者T-SPOT及肺泡灌洗液T细胞亚群检测结果，以T-SPOT的结果对肺结核和肺结节病进行筛查，发现T-SPOT结果阴性而T细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+比值有增高者，患肺结节病的概率较高。见表3。

表2　　两组患者T细胞亚群结果比较±s)

表3　　两种方法检测结果分析±s)

3　讨　　论

国外研究表明肺结节病的诊断常被延误，即使怀疑为肺结节病的患者仍存在延误诊断的情况，且常被误诊为肺结核病，并已按照结核病治疗方案进行治疗。肺结节病与肺结核的鉴别诊断仍是目前医疗领域的一大难点。

近年来，正电子发射计算机断层显像技术在的诊断中崭露锋芒[4-5]。有研究报道，肺结节病患者经激素治疗后肺泡灌洗液中淋巴细胞比例及CD4+/CD8+比值较治疗前均有明显下降，进一步提示肺泡灌洗液检查对肺结节病活动性的判断价值[6]。也有学者提出，检测肺泡灌洗液中HLA-DR+、CD8+T细胞及自然杀伤细胞可提高诊断的准确性，可以巩固肺泡灌洗液检查在肺结节病诊断中的地位[7-8]，为进一步研究肺结节病的发展和诊断提供线索。同时T-SPOT检测时间较短，并具有较高的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，是结核病的理想筛查方法[9-10]，肺泡灌洗液中T细胞亚群检测可作为肺结节病的辅助诊断。

本研究采用T-SPOT和肺泡灌洗液T细胞亚群进行检测，结果显示在T-SPOT中肺结核组的阳性率为90.2%，肺结节组阳性率为4.0%，肺结核组患者的阳性率明显高于肺结节病组，差异有统计学意义(P<0.05)。通过此项检测能初步对两种疾病进行鉴别。随后进行肺泡灌洗液中T细胞亚群的检测，结果显示肺结节病患者较肺结核患者CD3+和CD4+T细胞明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)，CD8+T细胞有所下降,差异无统计学意义(P>0.05)，CD4+/CD8+比值升高,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步以T-SPOT的结果进行肺结核和肺结节病的筛查，发现T-SPOT结果阴性而T细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+的比值有增高者，为肺结节病的概率较高。但是本研究中所涉及的样本量较少，故其临床应用价值尚待加大样本量分析及进一步深入探讨证实。

综上所述，在充分考虑患者临床症状的基础上，首先通过T-SPOT检测初步排除肺结核，在检测出阴性结果后通过肺泡灌洗液的T细胞亚群的进一步检测能很大程度帮助临床医师进行肺结核与肺结节病的鉴别诊断。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.046

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1673-4130(2016)17-2465-03

2016-02-21

2016-04-16)