阿里木江·赛提瓦尔地, 刘俊远, 俞婷婷, 韩志刚

新疆医科大学附属肿瘤医院 肺内一科(乌鲁木齐　830011)



抗人stathmin单克隆抗体和紫杉醇对肺癌细胞系QG-56的生长抑制和诱导凋亡作用*

阿里木江·赛提瓦尔地, 刘俊远, 俞婷婷, 韩志刚△

新疆医科大学附属肿瘤医院 肺内一科(乌鲁木齐830011)

目的探讨抗人stathmin单克隆抗体(McAb)、紫杉醇(PTX)单用或联合应用对肺癌细胞系QG-56的生长抑制及诱导凋亡作用。方法以不同浓度的抗人stathmin McAb、PTX分别组成McAb组、PTX组和联合用药组，另设不加药的对照组，分别作用于QG-56细胞24、48、72、96 h，观察细胞数量和形态的变化，MTT法检测各组QG-56细胞的增殖抑制情况，采用流式细胞仪检测各组QG-56细胞凋亡率。结果不同浓度的McAb组、PTX组和联合用药组细胞数量明显减少、形态不规则，部分细胞核固缩和胞质减少，而对照组细胞生长状态良好。抗人stathmin McAb、PTX单用和联合应用均能抑制QG-56细胞增殖，呈剂量-时间依赖效应，联合用药组细胞抑制率较McAb组、PTX组明显增大，差异有统计学意义(P<0.05)，两药联用具有协同效应。抗人stathmin McAb、PTX单用与联用均能诱导QG-56细胞凋亡，联合用药组诱导凋亡作用更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。结论抗人stathmin McAb、PTX单用与联用均能抑制QG-56细胞增殖，诱导其凋亡，两药联合作用于人肺癌QG-56细胞具有协同作用。

stathmin单克隆抗体; 紫杉醇; 肺癌; 增殖; 凋亡

肺癌是对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，化疗是晚期肺癌的主要治疗方法，但晚期肺癌患者对化疗药物的耐受性较差，目前靶向治疗成为肺癌研究的热点[1-2]。stathmin是近年来发现的肿瘤基因治疗的新靶点，是细胞增殖和分化过程中至关重要的可溶性蛋白质，其高表达于多种恶性肿瘤患者[3]。研究[4-5]显示，细胞内、外多种生物活性物质可与stathmin直接或间接作用，引起细胞生物学改变，控制细胞周期，改变细胞增殖、分化和活性等。紫杉醇(PTX)是目前世界公认的广谱、强活性抗癌药物，具有独特的抗癌机理，尤其是对肺癌、卵巢癌、乳腺癌的治疗有效率高达75%[6]。本研究旨在探讨抗人stathmin单克隆抗体(McAb)与PTX单用或联合应用对人肺癌QG-56细胞的生长抑制及诱导凋亡作用，现报道如下。

1　材料与方法

1.1细胞与主要试剂

人肺癌细胞系QG-56来自新疆医科大学抗体工程研究所；PTX购于北京华素制药股份有限公司；抗人stathmin McAb由新疆医科大学抗体工程研究所制备；新生小牛血清、0.25%胰酶溶液、RPMI-1640培养液均购于美国Gibco公司；AnnexinV/ PI染色试剂盒购于深圳精美公司；噻唑蓝(MTT)、分析纯二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养将人肺癌细胞系QG-56接种于含10%胎牛血清、100 u/mL链霉素的IMDM培养基中，置于37 ℃、CO2浓度5%的孵育箱中培养。细胞为上皮样细胞，对数生长期时每2～3 d传代1次， 待细胞生长接近80%时收集并用于实验操作。

1.2.2QG-56细胞形态变化观察取对数生长期QG-56细胞，2×105/孔接种于6孔板，4 h后按加入成分的不同分为3组。 McAb组：加入不同浓度(10、20、40、80、160)μg/mL的抗人stathmin McAb；PTX组：加入不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6) μg/mL的PTX；联合用药组：同时加入不同浓度的抗人stathmin McAb和PTX(McAb 10 μg/mL+PTX 0.1 μg/mL、McAb 20 μg/mL+PTX 0.2 μg/mL、McAb 40 μg/mL+PTX 0.4 μg/mL、McAb 80 μg/mL+PTX 0.8 μg/mL、McAb 160 μg/mL+PTX 1.6 μg/mL)。另设不加药的对照组。除对照组外，各组每一药物浓度均设5个复孔，分别处理24、48、72、96 h后于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.3MTT法检测QG-56细胞增殖的抑制率取对数生长期QG-56细胞，5×103/孔接种于96孔板，37 ℃、5% CO2培养4 h后，按加入成分不同分为3组：McAb组，PTX组和联合用药组(加入药物和药物浓度同1.2.2)，另设不加药的对照组。各组每一药物浓度均设5个复孔。培养24、48、72、96 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO。采用酶标仪测各孔OD490nm，计算各组抑制率。抑制率(%)=(对照组OD490nm-实验组OD490nm)/对照组OD490nm×100%。

1.2.4流式细胞术检测QG-56细胞凋亡率取对数生长期QG-56细胞，2×105/孔接种于6孔板，4 h后按加入成分的不同分为3组：McAb组、PTX组及联合用药组(加入药物和药物浓度同1.2.2)，另设不加药的对照组，各组每一药物浓度均设4个复孔。用0.25%胰酶溶液收集培养24、48、72、96 h的样本，加75%乙醇4 ℃固定24 h，PBS洗2次，1 mg/mL RNase A 37 ℃消化30 min，100 μg/mL碘化丙啶4 ℃染色20 min。采用流式细胞仪分析，每组样本计数分析104个细胞，最后应用ModFitl T V2.0软件处理数据。

1.3统计学方法

2　结果

2.1各组QG-56细胞形态的改变

加药前各组细胞数量、形态基本一致。培养48 h后，McAb组、PTX组及联合用药组细胞数量均减少，形态不规则，细胞核固缩，细胞质空泡或减少，细胞呈半悬浮状态；对照组培养24、48、72、96 h后，细胞生长良好、细胞数量随时间增加逐渐增多，细胞形态一致，染色质疏松，细胞质丰富。

2.2各组QG-56细胞的增殖抑制情况

2.2.1McAb、PTX对QG-56细胞的增殖抑制率

与阴性对照相比，McAb和PTX处理后QG-56细胞的增殖抑制率明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。随着浓度的增加和作用时间的延长，McAb和PTX对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，呈现时间(rMcAb=0.554，P=0.002；rPTX=0.492，P=0.001)和剂量(rMcAb=0.612，P=0.001；rPTX=0.591，P=0.001)依赖趋势(表1和表2)。

2.2.2McAb联合PTX对QG-56细胞的增殖抑制率联合用药组对QG-56细胞增殖的抑制作用较McAb组和PTX组单药处理时明显增强，差异有统计学意义(P<0.05)，析因方差分析显示，两药联用呈现交互效应，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表1　McAb对QG-56细胞增殖的抑制作用

表2　单用紫杉醇对QG-56细胞增殖的抑制作用±s)

表3　McAb和PTX联用对QG-56细胞增殖的抑制作用

2.3各组QG-56细胞凋亡率比较

联合用药组出现不同程度的细胞凋亡增加，且呈时间(r=0.576，P=0.001)和剂量(r=0.634，P=0.001)依赖趋势。同一时间点和不同浓度组间凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；同一药物浓度和不同时间点凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与McAb组、PTX组比较，联合用药组细胞凋亡率较高，差异有统计学意义(P<0.05)(表4～表6)。

表4　McAb作用后QG-56细胞凋亡率的改变

表5　PTX作用后QG-56细胞凋亡率的改变

表6　McAb和PTX单用或联用后QG-56细胞凋亡率的改变

3　讨论

肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，约2/3的患者确诊时已属中晚期，失去了手术治疗的机会。化疗为晚期肺癌的主要治疗方法，但随着治疗时间的延长，患者对化疗药物耐受性减弱，化疗效果不理想[7]。随着药物遗传学和基因学的迅速发展，研究[8]发现，肿瘤组织中的基因表达与肿瘤化疗疗效密切相关。因此，依据肿瘤患者组织中基因表达情况，采用靶向治疗策略提高肿瘤患者化疗效果，减少毒副反应成为新的治疗思路。

stathmin是从淋巴瘤中筛选的特征性基因的表达产物，属于高度保守的胞质磷蛋白，可在细胞周期的不同阶段通过其磷酸化和去磷酸化作用对细胞的维管系统动态平衡的调节发挥重要作用，高效调节细胞的增殖与分化[9]。stathmin在多种恶性肿瘤组织中均有高水平表达，为肿瘤基因治疗提供了一个新的靶点，通过靶向治疗，抑制其表达可干扰恶性肿瘤细胞的有丝分裂，从而影响肿瘤细胞的增殖[10]。研究[11-12]报道，stathmin的高水平表达是恶性肿瘤细胞维持高增殖率和转化表型所必须的，抑制stathmin基因表达，不仅能逆转恶性肿瘤表型，还可抑制肿瘤细胞增殖。紫杉醇是目前唯一一种具有独特抗微管作用机制的天然抗癌药物，主要从紫衫的树干和树枝中提取而成，不仅能促进微管聚合，形成稳定的微管聚合物，显著减少游离的微管数量，抑制细胞有丝分裂，还能抑制细胞增殖，最终导致癌细胞凋亡[13]。本研究结果显示，PTX和抗人stathmin McAb单用或联合应用均可明显抑制QG-56的增殖，诱导其凋亡，且增殖抑制作用和诱导凋亡作用均呈时间-剂量依赖关系；此外，两药联用比单用时的增殖抑制作用、诱导凋亡作用更明显，提示两药对肺癌细胞存在协同抑制作用。与原少斐等[14-15]研究报道相似，提示抗人stathmin McAb联合PTX治疗肺癌具有明显优势。

综上所述，抗人stathmin McAb、PTX单用与联用均能抑制QG-56细胞增殖，诱导其凋亡，两药联合应用对人肺癌QG-56细胞具有协同抑制作用，不仅为肺癌患者体内研究提供了基础和依据，还提供了新的研究思路和治疗方案，提示抗人stathmin McAb联合PTX应用具有良好的应用前景。

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Effect of Anti-human Stathmin Monoclonal Antibody and Paclitaxel on the Growth Inhibition and Inducing Apoptosis of Lung Cancer Cell Line QG-56

AlimijiangSaitiwaerdi,LiuJunyuan,YuTingting,HanZhigang△.

FirstDepartmentofInternalMedicineforLung,TheAffiliatedCancerHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi830011,China

ObjectiveTo explore the effect of anti-human stathmin monoclonal antibody (McAb) and paclitaxel (PTX) in single or combined application on the growth inhibition and inducing apoptosis of lung cancer cell line QG-56. MethodsThe single drug group and the combined drug group were set according to the different concentrations of anti-human stathmin McAb and PTX respectively, while the control group received no drugs. The drugs were used on QG-56 cells for 24, 48, 72 and 96 hours respectively to observe the changes of cell count and morphology. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the proliferation and inhibition of QG-56 cells, while flow cytometry (FCM) was adopted to detect the apoptotic rate of QG-56 cells. ResultsThe cell count reduced significantly, the morphology was irregular, and the partial karyopyknosis and cytoplasm decreased in the single drug group and the combined drug group with different concentration of drugs, while cells had favorable growth conditions in the control group. Anti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application could both inhibit the proliferation of QG-56 cells at a dosage-time-dependent manner. However, the combined drug group was significantly better in the inhibition rate of cells than the single drug groups (P<0.05), and the combination of two drugs had synergistic effect. Anti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application could both induce the apoptosis of QG-56 cells, but the combined drug group was more significant in inducing apoptosis (P<0.05). ConclusionAnti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of QG-56 cells, but the combination of two drugs has a synergistic effect on human lung cancer QG-56 cells.

Stathmin monoclonal antibody; Paclitaxel; Lung cancer; Proliferation; Apoptosis

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.010

中国高校医学期刊临床专项资金(No:11522538)

韩志刚，E-mail: 1378213986@qq.com

R734.2

A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.0959.004.html