魏　榕，伍忠军，杨玛丽，肖　翠，曹小华，阳　泰，刘　进△

1.成都医学院 生物医学系(成都　610500)；2.成都医学院 检验医学院(成都　610500)；3.成都医学院 科研实验中心(成都　610500)



甜瓜蒂中葫芦素提取工艺初探及其含量测定*

魏榕1，伍忠军1，杨玛丽2，肖翠1，曹小华1，阳泰3，刘进3△

1.成都医学院 生物医学系(成都610500)；2.成都医学院 检验医学院(成都610500)；3.成都医学院 科研实验中心(成都610500)

目的比较65%乙醇和无水乙醇回流提取法从甜瓜蒂中提取葫芦素的效率；同时比较甜瓜蒂纤维和甜瓜蒂粉末中葫芦素含量的差异。方法分别采用65%乙醇和无水乙醇加热回流法制备甜瓜蒂粉末提取液；采用无水乙醇加热回流法制备甜瓜蒂纤维提取液。通过HPLC测定提取液中葫芦素B、E和I的浓度。结果甜瓜蒂粉末采用无水乙醇制备的提取液中葫芦素B、E浓度均高于65%乙醇制备的提取液中葫芦素B、E浓度，差异有统计学意义(P<0.05)；但葫芦素I浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。甜瓜蒂纤维采用无水乙醇制备的提取 液中也含有较高浓度的葫芦素B、E、I。结论采用乙醇加热回流法从甜瓜蒂中提取葫芦素，无水乙醇提取效率高于65%乙醇。甜瓜蒂粉末中葫芦素含量虽高于甜瓜蒂纤维，但甜瓜蒂纤维中仍有较高含量的葫芦素，不应当作废弃物处理。

甜瓜蒂；葫芦素；提取工艺

葫芦素是一类从葫芦科植物中分离得到的四环三萜类化合物，类型有葫芦素A、B、C、D、E、F和I等。植物次生代谢产物研究[1]表明，植物产生葫芦素B和E后，可通过代谢葫芦素B和E产生其他类型葫芦素。甜瓜蒂为葫芦科甜瓜属植物甜瓜CucumismeloL.的果梗，是提取、制备葫芦素类化合物的重要原料[2]。从甜瓜蒂中提取葫芦素，主要采用乙醇提取法，有研究[3]比较了55%、75%以及95%乙醇，最后优选55%乙醇用于甜瓜蒂中葫芦素提取。亦有研究[4]报道优选65%乙醇提取甜瓜蒂中葫芦素B。在一定范围内，含水量大虽可提高产品的一次性提取率，但会降低提取物的纯度[5]。因此，本研究着重比较65%乙醇浓度和无水乙醇回流提取法提取甜瓜蒂中葫芦素的效率。但目前大多研究[6-7]仅报道了甜瓜蒂粗粉在甜瓜蒂提取工艺中的使用，未见报道甜瓜蒂纤维中葫芦素含量的测定。本研究将测定甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维中葫芦素含量，以判断甜瓜蒂纤维是否可以作为提取原料使用。

甜瓜蒂中葫芦素主要含有葫芦素B、E[2]，因此，本研究将通过测定提取物中葫芦素B和E的含量来比较提取效率。另外葫芦素I被认为具有更强的抗肿瘤活性，本研究同时测定了葫芦素I的含量，以了解葫芦素I是否也是决定中药甜瓜蒂药效的关键组分。

1　仪器与试药

1.1仪器

美国Waters2695液相色谱仪；瑞士Buchi公司R210型旋转蒸发仪；梅特勒托利多ME104分析天平；Millipore A10超纯水机。

1.2试药

甜瓜蒂药材(产地：山东省莱西市马连庄镇)，经成都医学院生药学教研室游元元教授鉴定为葫芦科植物甜瓜的干燥果蒂；葫芦素B对照品(纯度 ≥ 98.67%)购于成都曼思特科技有限公司，批号：MUST-16022208；葫芦素E对照品(纯度 ≥ 95%)购于成都曼思特科技有限公司，批号：MUST-12092801；葫芦素I(纯度 ≥ 98%)购于美国Cayman Chemical公司；乙醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)，甲醇(色谱纯，美国赛默飞公司)。

2　方法

2.1色谱条件

C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Kromasil公司)；流动相：甲醇-水(65∶35，V/V)；流速：0.8 mL/min；检测波长230 nm；柱温30 ℃；进样量 5 μL。在此色谱条件下，供试品中葫芦素I、B、E的保留时间分别为8.5、11.5、13.2 min，与相邻色谱峰的分离度均>1.5，理论塔板数按葫芦素I、B、E计算分别不低于8 935、 10 767、 10 351(图1A-1B)。

2.2供试品溶液的制备

使用粉碎机破碎甜瓜蒂，得甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维。称取25 g甜瓜蒂粉末和25 g甜瓜蒂纤维，浸泡于250 mL无水乙醇，另称取25 g甜瓜蒂粉末浸泡于250 mL 65%乙醇中。80 ℃水浴加热回流提取，重复提取3次，每次1 h，将3次的提取液合并转移至500 mL容量瓶，加入无水乙醇定容至500 mL。

2.3对照品溶液的制备

称取2.2 mg葫芦素B、1.3 mg葫芦素E和2.5 mg葫芦素I，分别加入10 mL容量瓶中使用甲醇定容。对照品溶液中葫芦素B、E、I溶液浓度分别为：220、130、250 μg/mL。

2.4线性关系考察

2.5精密度试验

取混合对照品溶液，按2.1色谱条件，单次进样5 μL，重复进样5次。葫芦素B、E、I峰面积的RSD分别为1.49%、1.39%、1.58% (n=5)，说明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，于0、4、8、10、12 h， 按2.1色谱条件单次进样5 μL。供试品中葫芦素B、E、I峰面积RSD分别为1.63%、1.46%、1.52% (n=5)，结果表明供试品溶液在室温12 h内稳定。

2.7重复性试验

取同一供试品溶液，按2.1色谱条件单次进样5 μL，重复进样5次。葫芦素B、E、I的峰面积RSD分别为1.37%、1.52%、1.47% (n=5)，结果表明方法的重复性良好。

图1葫芦素对照品和甜瓜蒂无水乙醇提取物供试品的HPLC色谱图

注：A.葫芦素I、B、E 3种对照品混合溶液；B.甜瓜蒂无水乙醇提取物供试品溶液；1-葫芦素I；2-葫芦素B；3-葫芦素E

2.8加样回收率试验

称取6份已测定含量的供试品适量置于10 mL容量瓶，加入混合对照品溶液5 mL，使用甲醇定容。按2.1色谱条件单次进样5 μL，测定葫芦素B、E、I峰面积并计算含量。葫芦素B、E、I的平均回收率分别为101.82%、104.53%、99.07%，RSD分别为1.42%、1.71%、1.58%(n=6)。

2.9统计学方法

3　结果

3.1不同乙醇浓度加热回流提取甜瓜蒂中葫芦素的效率比较

采用65%乙醇和无水乙醇作为提取液对甜瓜蒂粉末进行加热回流提取，HPLC测定提取液中葫芦素B、E、I浓度，提取操作重复3次。结果表明，采用无水乙醇制备的甜瓜蒂提取液中葫芦素B、E的浓度均高于65%乙醇的提取液，差异有统计学意义(P<0.05)，但葫芦素I的浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1　　　　65%乙醇和无水乙醇提取液中葫芦素浓度比较

3.2甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维中葫芦素B、E、I含量比较

采用无水乙醇加热回流分别提取甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维，HPLC测定两种提取液中葫芦素B、E、I浓度，计算甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维中葫芦素含量，提取操作重复3次，结果表明，每克甜瓜蒂粉末中葫芦素B、E、I含量均高于甜瓜蒂纤维，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2　甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维葫芦素含量比较±s，mg/g，n=3)

4　讨论

本研究表明，无水乙醇加热回流提取比65%乙醇加热回流从甜瓜蒂中提取葫芦素效率更高。既往研究[4-5]也有比较55%、75%、95%乙醇以及不同料液比对葫芦素B提取效率的影响，但提取物中含有的水分影响了下一步的保存或纯化工作。无水乙醇回流提取液中葫芦素主要成分葫芦素B和E含量均高于65%乙醇，且最终产物中水份少，便于乙醇回收和纯化工作。

甜瓜蒂提取首先需将甜瓜蒂粉碎，但甜瓜蒂是甜瓜的梗部，含有大量纤维。以往研究[6-7]报道仅使用甜瓜蒂粉末，而未将甜瓜蒂纤维作为原料使用。本研究表明：尽管甜瓜蒂纤维中葫芦素含量低于甜瓜蒂粉末，但甜瓜蒂纤维中依然有较高含量的葫芦素，甜瓜蒂提取工艺中产生的大量纤维不应作为废弃物丢弃。

葫芦素I被认为具有更强大的抗肿瘤活性，葫芦素I可以通过激活RhoA/ROCK途径和抑制LIM激酶，抑制肌动蛋白和磷酸肌球蛋白Ⅱ共聚体的形成，影响细胞的迁移和分裂，诱导细胞发生凋亡[8]。葫芦素I还可以下调Aurora kinase A、Aurora kinase B 和Survivin表达，阻滞细胞周期在G2/M[9]；同时还能抑制STAT3磷酸化抑制肿瘤细胞增殖[10]。既往研究忽视了甜瓜蒂中葫芦素I的含量测定，本研究测定结果表明甜瓜蒂中有较高含量的葫芦素I。葫芦素I可能也是决定中药甜瓜蒂药效的关键组分，其含量和生物活性应该引起重视。

综上所述，本研究证实了无水乙醇加热回流提取甜瓜蒂中葫芦素的效率高于65%乙醇，同时还发现甜瓜蒂纤维中也有较高含量葫芦素，可作为提取原料使用；通过对比葫芦素I标准品，发现甜瓜蒂也有较高含量的葫芦素I。但液相色谱的结果并不能确定被测物质的结构，因此在未来的研究中还需要通过高效液相与质谱联用进一步确认。

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[2]郭梦鸿, 孙玉琦, 刘影,等. 葫芦科植物药材中葫芦素类成分的含量差异[J]. 中国医院药学杂志, 2015, 35(17): 1554-1558.

[3]冯淑萍. 甜瓜蒂提取工艺研究[J]. 中国药事, 2014(6): 614-617.

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Preliminary Study on the Extraction Process of Cucurbitacin from Cucumis Melo Pedicle and its Content Determination

WeiRong1,WuZhongJun1,YangMali2,XiaoCui1,CaoXiaohua1,YangTai3,LiuJin3△.

1.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofMedicalLaboratorySciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 3.CenterforScientificResearch,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo study and compare the extraction process of cucurbitacin from dry Cucumis melo pedicle by the heating reflux method with 65% ethanol and anhydrous ethanol and compare the cucurbitacin content of fibers and powders of Cucumis melo pedicle. MethodsThe powder extraction solution of Cucumis melo pedicle was prepared by the heating reflux method with 65% ethanol and anhydrous ethanol, and the fiber extraction solution was prepared by the heating reflux method with anhydrous ethanol. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method was adopted to assay the concentration of cucurbitacin B, E and I in the extraction solution. ResultsThe concentration of cucurbitacin B and E in the extraction solution obtained by anhydrous ethanol was significantly higher than in the extraction solution obtained by 65% ethanol (P<0.05), but there was no significant difference in the concentration of cucurbitacin I between the two groups (P>0.05). The fibers of Cucumis melo pedicle contained the relatively high concentrations of cucurbitacin B, E and I. Conclusion Anhydrous ethanol is more effective in the heating reflux method than 65% ethanol in extracting the cucurbitacin. The content of cucurbitacin in powders of Cucumis melo pedicle is much higher than in its fibers, but the fibers should not be discarded as waste since it contains the relatively high concentration of cucurbitacin.

Cucumis melo pedicle; Cucurbitacin; Extraction process

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.002

国家自然科学基金资助项目(No：81201668)；四川省教育厅基金资助项目(No：15ZB0234)；四川省大学生创新创业训练计划资助项目(No：201413705032)

刘进，E-mail：jinliu19871987@163.com

R284.2

A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.0958.002.html