李一鸣，王平

(湖北中医药大学 老年医学研究所 湖北省老年病中药新产品协同创新中心，湖北 武汉 430065)

·基础研究·

当归补血汤作用于四膜虫抗氧化基因
——抗氧化药物筛选新方法初探△

李一鸣，王平*

(湖北中医药大学 老年医学研究所 湖北省老年病中药新产品协同创新中心，湖北 武汉 430065)

目的：以经典方当归补血汤对四膜虫生长曲线和抗氧化酶基因的作用探讨筛选抗氧化药物的新方法。方法：将不同剂量的当归补血汤接种于嗜热四膜虫的培养液中，以无菌蒸馏水为空白对照，观察嗜热四膜虫的生长曲线，另外，对上述不同培养液中的嗜热四膜虫采用Real Time-PCR法测定嗜热四膜虫体内的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx4)、硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductases，TxnRd2)的基因表达。结果：当归补血汤干预组生长曲线与空白组相比有明显的提高。与空白组相比，嗜热四膜虫的GPx4、TxnRd2基因表达均显著升高。结论：当归补血汤能够明显改善四膜虫生长曲线，促进GPx4、TxnRd2基因mRNA表达，提示生物体生长曲线可能与抗氧化酶基因表达有关。

当归补血汤；抗氧化；嗜热四膜虫；GPx4；TxnRd2

嗜热四膜虫Tetrahymenathermophila是一种单细胞真核生物[1]，隶属于纤毛门寡膜纲膜口目四膜虫科四膜虫属。嗜热四膜虫被广泛用于污染物毒理学研究的模式生物，近年来常常被用作评估生态毒性以及生态风险评估，以超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)等抗氧化相关酶作为观察指标用以探究毒物对嗜热四膜虫的影响。基因组学研究表明四膜虫和人类基因有较高程度的相似性，因此以四膜虫作为分子生物学研究对象，探明药物或者毒物对高等生物作用机理有较为可靠的理论依据。有研究用抗菌剂三氯生(triclosan，TCS)和三氯卡班(triclocarban，TCC)干预四膜虫，发现TCS和TCC在环境相关浓度下均可干扰嗜热四膜虫的抗氧化机制，分别表现为SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)的活力增加，LDH活力的降低[2]。还有研究抗紫外滤光片的作用，以四膜虫为对象观测其细胞内SOD、GPx抗氧化酶的活性[3]。课题组基于四膜虫这种模式生物特点，利用竹节参、六味地黄丸、金贵肾气丸等具有补益作用的单味药物以及方剂，对嗜热四膜虫生长曲线、氧化酶及其相关基因进行研究[4-5]。本研究根据其生长曲线相关基因表达方便快捷的特点，前期筛选了多种中药，以经典方剂当归补血汤作用于四膜虫为研究对象，观察补益类方剂对四膜虫生长曲线、SOD及体内GPx4和TxnRd2基因表达的影响。

1 材料与仪器

1.1四膜虫

嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)(SB210株系)，由中国科学院水生生物研究所提供。

1.2试剂

朊蛋白胨(Proteose Peptone，Difco)，酵母提取物(yeast extract，Oxide)，葡萄糖、柠檬酸铁、碘化钾、冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)，碘晶体(广州化学试剂厂)，TRIZOL试剂(Invitrogen)，逆转录试剂盒(TaKaRa)，荧光定量试剂盒(TaKaRa)。

1.3仪器

INCO153型CO2培养箱(Memmert)，CX31显微镜(Olympus)，TGL20M 台式高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)，QL-901漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，DU730核酸-蛋白分析仪(BeckMan Coulter)，CFX96荧光实时定量PCR仪器(Bio-rad)。

1.4药物制备

1.4.1四膜虫培养基2%朊蛋白胨、0.1%酵母提取物、0.2%葡萄糖、0.003%柠檬酸铁，溶于双蒸水，经121℃灭菌20min。

1.4.2药物 黄芪、当归(湖北天际中药饮片有限公司，批号：20150318)，当归补血汤方由黄芪、当归组成，取黄芪25g、当归5g，用300mL双蒸水充分煎煮2次，趁热抽滤，合并药液，浓缩为0.25g·mL-1药液，然后用0.22μm微孔滤膜过滤3遍，得到药液，备用。

1.4.3鲁哥试剂 取碘化钾20.0g、碘晶体10.0g、冰醋酸20.0mL，充分溶解后，去离子水定容至200mL，避光保存。

2 方法

2.1培养及给药

取长势良好的对数生长期四膜虫，按培养基总体积的0.2%(500μL)接种于培养基25mL中，27℃培养传代。主要采用药物直接添加入培养基的方法干预四膜虫生长曲线，观察当归补血汤对四膜虫抗氧化的影响。分别在无菌培养液的6孔板中加入不同浓度的药液，接种对数生长期的嗜热四膜虫，每个浓度分别设3个平行，另设空白对照。

2.2计数

取200μL混匀的嗜热四膜虫培养体系用1μL鲁哥试剂固定，分别在不同温育时间取样计数。

嗜热四膜虫在显微镜下的计数方法：用移液枪取1μL固定液，用血细胞计数板进行计数，每隔3h进行1次计数，记录每次培养液中的四膜虫个数。

2.3GPx4、TxnRd2基因表达

在六孔板中取长势良好的对数生长期四膜虫，培养基中四膜虫浓度为(2～3)×105个·mL-1，总RNA提取参照Trizol试剂盒的说明书步骤，总RNA最终溶于50μL以DEPC处理过的双蒸水中，随后用DU730核酸-蛋白分析仪检测RNA浓度和纯度。

取提取后的RNA经逆转录为cDNA，每个样本进行荧光定量以测定GPx4以及TxnRd2基因的表达，以18s作为内参基因，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成并经质量检测，引物序列见表1。

表1 GPx4、TxnRd2及内参基因引物序列

反应体系：Real Time-PCR反应选用TaKaRa公司的SYBR PremixExTaqTM定量扩增反应体系，PCR管中加入SYBR PremixExTaqTM(2×)10 μL，逆转录反应产物2 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。充分混匀，去除气泡，离心使液体集中到管底，反应体系总体积20 μL。

扩增条件：PCR管放入Real Time-PCR仪中，设定反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，共进行40个循环，65～96 ℃绘制熔解曲线，以△Ct值及2-△△Ct进行数据分析。以ΔCt值以及2-ΔΔCt对Real Time PCR实验数据进行分析。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=Ct给药组-Ct空白对照组。

2.4统计学处理

3 结果

3.1当归补血汤对四膜虫生长曲线的影响

由表2可知，与空白组比较，当归补血汤能够明显影响四膜虫生长曲线。由图1可观察到，15h后四膜虫的生长量达到平台期，随着药物浓度的增加，四膜虫平台期数量明显提高。

表2 当归补血汤对四膜虫生长曲线的影响

图1 当归补血汤对四膜虫生长曲线的影响

3.2GPx4、TxnRd2基因的表达

与空白组比较，给药组的GPx4、TxnRd2基因表达有不同程度的上调，当归补血汤对TxnRd4基因表达的促进程度明显高于GPx4。由表3中2-ΔΔCt可观察到随着给药浓度的增加，GPx4、TxnRd2基因mRNA的表达有不同程度的上调。图2显示在40个循环期内皆达到DNA复制平台期说明反应体系稳定，引物扩增效率较高。图3溶解曲线为单峰，溶解曲线均一，说明DNA产物相同，退火温度合适，为特异性扩增。

表3 不同浓度当归补血汤对四膜虫GPx4、TxnRd2 基因表达的影响

图2 Real Time-PCR扩增曲线

图3 Real Time-PCR熔解曲线

4 讨论

本实验以补益气血延缓衰老为主要依据，实验方用当归补血汤，出自李东垣《内外伤辨惑论》，主要治疗气血亏损、阳浮于外之证。现代研究中发现黄芪、当归能增加抗氧化酶活性，提高机体对抗自由基对机体的损伤[6]。目前中医药对抗衰老中药研究越来越多，也逐渐深入。建立一个合理、有效且便利的药物筛选方法能够帮助我们更好地发掘药物以及药物的有效成分，使药物的研发更有靶向性，更快在临床上发挥作用。

GPx-4是硒蛋白谷胱甘肽氧化还原酶(GPx)家族众多氧化还原酶类的一种，作为一种抗氧化酶在细胞生理中发挥重要作用[7]，而在真核细胞生物对抗脂质过氧化当中更是起着无可替代的作用[8]。GPx-4同样也是哺乳动物细胞中唯一能够直接还原生物膜上磷脂氢过氧化物的抗氧化酶，它能够清除过多的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)。ROS是氧化还原代谢中一类常见产物，若体内代谢平衡失调会诱发诸如癌症及多种退化性疾病，这些疾病的发生均与ROS对细胞损伤相关[9]。Gpx-4通过清除活性氧的细胞毒性作用，保护细胞免受氧化应激损伤，从而起到防治疾病的作用。

真核生物的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductases，TR)主要有3类：TR1(常见有TrxR1，TxnRd1或TrxRα)，TR3(TrxR2，TxnRd2，TrxRβ) 以及硫氧还蛋白-谷胱甘肽还原酶(thioredoxin glutathione reductase，TGR；主要有TR2，TxnRd3[10]。TR1和TR3两种还原酶机制已经较为明确，TxnRd2是哺乳动物体内三种硫氧还蛋白还原酶基因的一种，主要在线粒体内发挥作用[11]。有证据表明可以通过改变体内氧化-抗氧化的平衡来阻碍疾病发生、延缓衰老的进程[12]。

本实验以当归补血汤经典方剂干预四膜虫的生长，由表2结果可观察到，随着药物浓度的增加，给药组对于空白组平台期有明显的提高，提示当归补血汤对四膜虫的生长繁殖产生影响，可能是通过抗氧化作用影响四膜虫的寿命。加入当归补血汤的四膜虫抗氧化基因GPx-4、TxnRd2与空白组比较有较为明显的升高，如表3所示，提示当归补血汤能够提高基因的表达量。通过表3还可观察到，当归补血汤对TxnRd2基因表达作用明显强于GPx-4。其中GPx-4基因主要影响细胞内抗氧化反应酶，作用体现在保护生物膜系统免受氧化损伤；而TxnRd2主要作用于线粒体内的氧化还原反应，故我们推测当归补血汤可能主要是通过调控氧化/抗氧化平衡对嗜热四膜虫生长周期产生影响。由于GPx-4抗氧化还原酶的作用对微量元素硒有一定需求，并以硒蛋白的形式发挥作用，因此尚需进一步试验进行验证。实验结果表明当归补血汤对嗜热四膜虫生长曲线可能是通过影响GPx-4、TxnRd2基因表达来得以实现。目前对抗氧化药物的筛选一般利用动物模型或者建立相应的细胞模型，通过检测血液、组织及细胞中抗氧化酶的含量达到筛选中药以及活性部位的目的。动物模型操作简单但实验周期较长，不稳定因素较多，细胞模型建立操作较为复杂与繁琐。而四膜虫作为一个单细胞生物用作筛选抗氧化药物，实验周期较短，实验室培养简单，实验结果准确[13]。许多疾病如衰老、糖尿病、心血管疾病等的发生、发展与机体氧化应激密切相关，嗜热四膜虫能够帮助寻找高效、低毒的抗氧化药物，建立快速有效的筛选方法和筛选模型具有重要意义。课题组希望通过前期研究，建立以四膜虫为模式生物用于抗氧化药物筛选的一种新方法，以期为后期研究中药配伍相互作用提供可靠依据。

在基础研究中嗜热四膜虫一直处于前沿地位，其细胞内有两种细胞核，因此四膜虫犹如一个丰富的基因库，为遗传物质研究提供了良好的基础。课题组希望通过观察研究方剂对四膜虫的影响，以期建立一个较为理想的药物筛选模型，由于其具有实验周期短、针对性强的特点，有望在机制研究、药物筛选等方面发挥重要的作用。

[1] 缪炜.原生动物四膜虫“小材”有“大用”[J].生物学通报，2010，45(12)：1-4.

[2] 高礼，程鹏，白琦锋，等.环境相关浓度三氯生和三氯卡班暴露对嗜热四膜虫体内抗氧化酶活力的影响[J].环境与健康杂志，2013，30(12)：1048-1050.

[3] Gao L，Yuan T，Zhou C，et al.Effects of four commonly used UV filters on the growth，cell viability and oxidative stress responses of the Tetrahymena thermophila[J].Chemosphere，2013，93(10)：2507-2513.

[4] 汤琪.《内经》地域养生思想探讨及恩施道地中药材对模式生物四膜虫的抗氧化作用研究[D].武汉：湖北中医药大学，2013.

[5] 郭岚.《内经》长寿理论与培元固本治法延缓衰老作用的研究[D].武汉：湖北中医药大学，2013.

[6] 戚晓利，徐秀芳，魏晓东.当归对D-半乳糖衰老模型小鼠抗氧化系统的研究[J].黑龙江医药科学，2003，26(1)：2-2.

[7] 杜小红，熊咏民，代晓霞.GPx-4功能及其多态性研究进展[J].国外医学：医学地理分册，2012(1)：55-59.

[8] 付瑞燕，陈坚，李寅.谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶系统在微生物细胞抗氧胁迫系统中的作用[J].生物工程学报，2007，23(5)：770-775.

[9] 孙娟，陈瑗，周玫，等.MnSOD与GPx过表达保护活性氧诱导细胞死亡的效应比较[J].南方医科大学学报，1997，17(4)：269-272.

[10] Gerashchenko M.Redox regulation of protein translation in eukaryotes[J].Dissertations & Theses-Gradworks，2014，48(1-2)：388-403.

[11] Sibbing D，Pfeufer A，Perisic T，et al.Mutations in the mitochondrial thioredoxin reductase gene TXNRD2cause dilated cardiomyopathy[J].Eur Heart J，2011，32(9)：1121-1133.

[12] Bo H，Jiang N，Ji L L，et al.Mitochondrial redox metabolism in aging：Effeet of exereise interventions[J].Journal of Sport & Health Science，2013，2(2)：67-74.

[13] 傅诚杰，俞婷，缪炜，等.四膜虫：毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物[J].动物学杂志，2005，40(1)：108-113.

EffectsofDangguiBuxueDecoctiononmRNAExpressionofGPx4andTxnRd2inTetrahymenaThermophile——ANewMethodforAnti-oxidativeDrugDiscovery

LIYiming，WANGPing*

(InstituteofGeratology，HubeiUniversityofChineseMedicine，CollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicineofNewProductsforGeriatrics，Wuhan430065，China)

Objective：To study the effects of Danggui Buxue decoction on mRNA expression of GPx4 and TxnRd2 inTetrahymenathermophile.Methods：T.thermophilagrowth was intervened by using the boil-free granule of traditional Chinese medicine.Four different concentrations of Danggui Buxue decoction were added into culture medium ofT.thermophile，and each concentrations with two parallel designs，by setting a group using sterile distilled water as blank control.Processing of gene glutathione peroxidase (GPx4) and thioredoxin reductases (TxnRd2) expression data generated by quantitative real-time RT-PCR.Results：Compared with blank control group，the growth curve of medicine intervention went up significantly.Results also showed that the expression level of GPx4 and TxnRd2 were increased by Danggui Buxue decoction.Conclusion：Danggui Buxue decoction could increase theT.thermophile’s growth curve，which may be related to GPx4 TxnRd2 gene expression.

Tetrahymenathermophile；Danggui Buxue decoction；GPx4；TxnRd2

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.009

2015-09-15)

国家自然科学基金委重点项目(81130064)

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王平，博士，二级教授，博士生导师，研究方向：老年脑病中医药防治规律；E-mail：pwang54@aliyun.com