杨丹，王洪礼，马丹宁，王延年*

(1.沈阳药科大学，沈阳 110016；2.沈阳伟嘉牧业技术有限公司，沈阳 110143)

不同发酵条件对淡豆豉中总异黄酮含量及蛋白酶活力的影响△

杨丹1，王洪礼2，马丹宁1，王延年2*

(1.沈阳药科大学，沈阳110016；2.沈阳伟嘉牧业技术有限公司，沈阳110143)

目的：建立淡豆豉中总异黄酮的含量测定方法，研究不同发酵条件对淡豆豉中总异黄酮及蛋白酶活力的影响。方法：采用UV法，以染料木素为标准品，在最大吸收峰261nm处测定黑豆、自然发酵的淡豆豉、米曲霉发酵的淡豆豉、黑曲霉发酵的淡豆豉中总异黄酮含量；以福林法测定蛋白酶活力。结果：黑豆中的总异黄酮的含量为7.77mg·g-1，自然发酵淡豆豉总异黄酮为8.08mg·g-1，米曲霉发酵淡豆豉总异黄酮为8.87mg·g-1，黑曲霉发酵淡豆豉总异黄酮含量为10.99mg·g-1。平均加样回收率100.09%，100.34%，99.76%，99.87%，相对标准偏差为为1.10%，1.28%，1.22%，1.24%。酶活力测定结果为：黑豆190.7U·g-1、自然发酵淡豆豉309.4U·g-1，米曲霉发酵淡豆豉474.9U·g-1，黑曲霉发酵淡豆豉500.0U·g-1。结论：UV法作为检验淡豆豉中异黄酮含量的一种手段，方法简便、准确、重现性好。单一菌种发酵淡豆豉异黄酮含量和酶活力均高于黑豆和自然发酵淡豆豉。

淡豆豉；总异黄酮；黑曲霉；米曲霉

中药淡豆豉是由黑豆的成熟种子和青蒿、桑叶等中药经发酵加工而成，具有解表除烦、宣发郁热等功效[1]。黑豆中含有一些抗营养因子，对动物的肠道结构具有很大的破坏作用[2]。黑曲霉菌种菌丝体易成型，培养条件粗放，产酶能力强、酶系丰富，生长温度范围较宽，有利于常年生产等优点。米曲霉是一种需氧真菌，稳定性高，能产蛋白酶、淀粉酶和糖化酶等多种酶，能使豆类食品中的蛋白质和淀粉得到了较好的分解。淡豆豉中含有黑豆的多种异黄酮成分，牛丽颖等[3]曾发现豆豉中染料木素、大豆苷元等异黄酮成分的含量均高于原料大豆。有研究表明，异黄酮不仅能够提高动物繁殖力，消除体内自由基、提高免疫力，而且还能显著地抑制霉菌毒素对动物肝功能和生长性能的影响[4-5]。目前，有关淡豆豉自然发酵的报道较多，而利用单一菌种进行发酵的研究报道较少。通过微生物法发酵黑豆，不仅可以提高黑豆中蛋白的含量，将黑豆中的大豆异黄酮糖苷直接转化为苷元[6]，而且还可以降解黑豆中存在的抗营养因子、多糖和蛋白质等，使其变成利于动物消化吸收的低分子糖、小肽和氨基酸，从而提高发酵黑豆在食品中的利用价值[7]。本实验尝试采用米曲霉和黑曲霉发酵黑豆，利用其霉系强大的产酶能力降解黑豆中的多糖和蛋白质，使其转化为利于消化、吸收利用的低分子糖、小肽和氨基酸，并使得发酵淡豆豉中药效成分异黄酮类含量提高，更有利于发挥药效。

1 材料与仪器

1.1实验材料与试剂

黑豆，购自沈阳，经王延年副教授鉴定为豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟种子。桑叶，采自沈阳，经王延年副教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶。青蒿，采自沈阳，经袁久志副教授鉴定为菊科植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分。黑曲霉孢子粉，购自济宁长泰生物科技有限公司。米曲霉孢子粉，购自济宁长泰生物科技有限公司。染料木素标准品(glycitin，中国食品药品检定研究院(批号：111704-201302)，纯度均≥98%。酪氨酸，购自中国食品药品检定研究院(批号：140609-201513)，纯度≥98%。酪蛋白，购自上海源叶生物科技有限公司(批号：YY10701)，含量(N计)≥14%。福林试剂，购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2实验仪器

QE-100克型高速中药粉碎机(浙江省武义县屹立工具有限公司)；JY202型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；SG3200H型超声波清洗机(上海冠特超声仪器有限公司)；DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；HW250B恒温恒湿箱(天津泰斯特仪器有限公司)；酶标仪(BIO-RAD)；303-0型台式培养箱(北京市永光明医疗仪器厂有限公司)；紫外检测器(UV-1700)等。

2 方法与结果

2.1不同发酵工艺的淡豆豉的制备

自然发酵：取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎煮液拌入净大豆1000g中，待吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，用剪过的桑叶、青蒿渣覆盖，于恒温恒湿培养箱内闷至发酵至黄衣上遍时，取出，略蒸，干燥，即得。

黑曲霉菌种发酵：取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎煮液拌入净大豆1000g中，待吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，接入黑曲霉菌种，用剪过的桑叶、青蒿渣覆盖，于恒温恒湿培养箱内闷至发酵至黄衣上遍时，取出，略蒸，干燥，即得。

米曲霉菌种发酵：取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎煮液拌入净大豆1000g中，待吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，接入米曲霉菌种，用剪过的桑叶、青蒿渣覆盖，于恒温恒湿培养箱内闷至发酵至黄衣上遍时，取出，略蒸，干燥，即得。

2.2标准品溶液的配制

精密称取染料木素标准品4.1mg，80%的甲醇溶液定容至10mL容量瓶，得到0.41mg·mL-1染料木素标准储备液。

2.3供试品溶液的配制

取黑豆、自然发酵、黑曲霉、米曲霉发酵的淡豆豉粉末1g，精密称定，加80%甲醇溶液20mL，超声提取2次，每次30min，滤过，用80%甲醇溶液洗涤滤渣，置50mL量瓶中，加80%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。

2.4标准品及供试品最大吸收峰的确定

将标准品及试样溶液在紫外光谱仪上扫描200～300nm处的吸收情况，结果得到了标准品及试样的最大吸收峰，且在最大吸收峰周围干扰较少，因此，将此最大吸收峰作为标准品及试样的检测波长。

2.5标准曲线的制备

精密吸取标准溶液0.03、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18mL，分别定容至10mL，得线性范围为1.23μg·mL-1～7.38μg·mL-1的浓度梯度标准溶液。以80%甲醇水溶液为空白溶液，紫外分光光度计在最大吸收波长处检测吸光度，检测结果见表1。以吸光度A为纵坐标，浓度(X)为横坐标，得校正曲线方程，见图1。回归方程：A=0.1078X+0.0367，R2=0.9996，表明染料木素在1.23μg·mL-1～7.38μg·mL-1的浓度范围内呈良好线性关系。

表1 染料木素校正曲线与回归方程

图1 染料木素校正曲线与回归方程

2.6精密度试验

精密吸取标准品溶液0.1mL，分别置于5只10mL容量瓶中，按照2.5校正曲线下操作，测定吸收度及RSD，结果吸收度的平均值为0.471，RSD为1.63%，表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取黑豆、自然发酵淡豆豉、黑曲霉发酵淡豆豉、米曲霉发酵淡豆豉供试品溶液各1mL，分别置于10mL容量瓶中，分别在0、2、4、8、16、20、24h在最大吸收波长处检测吸光度，考察供试品溶液的吸光度值及RSD。结果吸光度的平均值分别为0.207，0.213，0.226，0.278，RSD分别为0.52%，0.57%，0.82%，0.83%表明供试样品在24h内稳定。

2.8重复性试验

取同一批样品5份，按照2.3供试品溶液制备项下进行制备，再分别精密吸取样品液1mL置于10mL容量瓶中，按2.5校正曲线制备项操作，于最大吸收波长处依次测定吸光度计算供试品中的总异黄酮含量，结果总黄酮平均含量分别为7.78mg·g-1，8.06mg·g-1，8.85mg·g-1，11.10mg·g-1，RSD分别为1.24%，1.19%，1.21%，0.98%。表明该方法重现性良好。

2.9加样回收率

精密称取(相当于染料木素)的已知含量的4种样品各5份，每份2g，分别精密吸取染料木素对照品适量，按照“2.3供试品溶液制备方法”制备，在最大吸收波长处测定吸光度，并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率实验

通过计算结果可以得知，黑豆的平均回收率为100.09%，RSD为1.10%。自然发酵淡豆豉平均回收率为100.34%，RSD为1.28%，米曲霉发酵淡豆豉平均回收率为99.76%，RSD为1.22%，黑曲霉发酵淡豆豉平均回收率为99.87%，RSD为1.24%。

2.10试样中异黄酮的含量测定

分别精密吸取样品液1mL置于3只10mL容量瓶中，按2.5校正曲线制备项操作，在最大吸收波长处测得4个供试品溶液的吸光度，按校正曲线方程计算含量，并计算试样中异黄酮的百分含量，结果见表3。

表3 试样中异黄酮的含量

测定结果表明，黑豆中的总异黄酮含量为7.77 mg·g-1，RSD值为1.2%。黑豆中的总异黄酮含量为7.77 mg·g-1，RSD值为1.2%。黑豆中的总异黄酮含量为7.77 mg·g-1，RSD值为1.2%。自然发酵淡豆豉中的总异黄酮含量为8.08 mg·g-1，RSD值为1.0%。米曲霉发酵淡豆豉中的总异黄酮含量为8.87 mg·g-1，RSD值为1.1%。黑曲霉发酵淡豆豉中的总异黄酮含量为10.99 mg·g-1，RSD值为1.4%。

2.11蛋白酶活力的测定[8-9]

2.11.1 酪氨酸含量标准曲线的制备

酪氨酸在105 ℃干燥至恒重，精确称取0.1g，加入一定量的HCl使其溶解，加蒸馏水定容至1000mL，取10mL容量瓶5只，按照表中将酪氨酸溶液稀释成不同浓度。另取六只试管，编号1，加入相应的盐酸蒸馏水溶液1mL为空白对照，编号2～6，依次加入不同浓度的酪氨酸溶液1mL。，再分别加0.4mol·L-1碳酸钠5mL，福林试液1mL，蒸馏水2mL，立即摇匀，置于40 ℃水浴锅中保温20min，显色完全(蓝色)。酶标仪与660nm波长处测定吸光度，测定三次取平均值，将2～6号管所测吸光度减去1号管的吸光度得实测值Y，结果见表4。以Y为纵坐标，酪氨酸的浓度(X)为横坐标，作标准曲线图，结果见图2，回归方程为：A=0.021 9X+0.015 2，R2=0.999 4。

表4 酪氨酸的标准曲线

图2 酪氨酸的标准曲线

2.11.2 酶液的制备 分别称取未发酵的与发酵后的淡豆豉5 g，充分研细，40℃干燥30 min，加水100 mL蒸馏水，置40 ℃恒温水浴锅中保温1 h，搅拌，取出，离心，取上清液，即酶液。

2.11.3 蛋白酶活力测定 将酶液以PH6.8磷酸钠缓冲液稀释10倍，取1 mL稀释液至离心管，于40 ℃水浴预热5 min，同时量取适量2%酪蛋白溶液预热5 min，精确吸取预热过的2%酪蛋白溶液1 mL加至离心管，立即计时，保温10 min后立即加入0.4 mol·L-1三氯醋酸溶液2 mL，终止酶的反应，继续于水浴中保温20 min，使残存蛋白质完全沉淀，离心滤过。取1 mL滤液加至试管，加0.4 mol·L-1碳酸钠5 mL，福林试液1 mL，蒸馏水2 mL，立即摇匀，置40 ℃水浴中保温发色20 min，于660 nm波长测光吸收度。另取1只离心管作空白对照，取1 mL稀释酶液，先加入2 mL三氯醋酸使酶失活，再加入2%酪蛋白1 mL，其他步骤同前。样品分别测定3次。测定结果见表5。

表5 样品中蛋白酶活力测定

通过测定结果可得，黑豆的蛋白酶活力为190.7 U·g-1，自然发酵淡豆豉的蛋白酶活力为309.4 U·g-1，米曲霉发酵淡豆豉的蛋白酶活力为474.9 U·g-1，黑曲霉发酵淡豆豉的蛋白酶活力为500.0 U·g-1

3 讨论

3.1总异黄酮检测波长的确定

将标准品及试样溶液在UV-1700紫外分光光度计上扫描200～300nm处的吸收情况，结果发现标准品及试样均在261nm处有最大吸收，且最大吸收峰周围均干扰较少。故选择将261nm作为染料木素含量测定的检测波长。

3.2不同发酵条件对淡豆豉中总异黄酮含量的影响

通过对黑豆、自然发酵淡豆豉、黑曲霉发酵淡豆豉、米曲霉发酵淡豆豉中总异黄酮含量比较发现，黑豆中的总异黄酮的含量最少只有7.77mg·g-1，自然发酵淡豆豉总异黄酮含量为8.08mg·g-1，米曲霉发酵淡豆豉总异黄酮含量为8.87mg·g-1，黑曲霉发酵淡豆豉总异黄酮含量最多为10.99mg·g-1.利用黑曲霉和米曲霉发酵淡豆豉总异黄酮的含量均较高于黑豆和自然发酵淡豆豉的含量。这可能是大豆在发酵过程中微生物消耗了黑豆中部分蛋白质和淀粉，而黑豆次生代谢产物损失较少，从而发酵豆制品总异黄酮相对含量增加。经过研究对比，确定用一种简单易行的紫外分光光度法对其主要有效成分异黄酮类成分进行测定，建立了一种淡豆豉的质量控制标准。本法简便、快速、选择性好、线性范围宽、重复性好、能全面反映样品中大豆异黄酮的总含量，适用于淡豆豉中总异黄酮的质量检测和测定，尤其是生产过程的质量控制。

3.3不同发酵条件对淡豆豉中酶活力的影响

淡豆豉为常用药食同源物质，其最新报道有降血糖、降血脂的作用，但有关淡豆豉不同菌种发酵中总异黄酮以及酶活力的质量分析报道较少。笔者研究得出，黑豆中的蛋白酶活力为190.7U·g-1、自然发酵淡豆豉的酶活力为309.4U·g-1、米曲霉发酵淡豆豉的酶活力为474.9U·g-1、黑曲霉发酵淡豆豉的酶活力为500.0U·g-1。淡豆豉的酶活力测定，也可以作为其发酵过程控制指标之一。

研究表明，利用接单一菌种发酵法处理淡豆豉成本低，对黑豆的营养成分破坏较小，可以提高蛋白质含量，同时还能够降解黑豆中存在的一些抗营养因子，提高黑豆的营养价值。相比于米曲霉，黑曲霉发酵淡豆豉不产生真菌毒素，菌丝体易形成，有更加丰富的酶系，已成为淡豆豉生产新工艺研究的热点。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：化学工业出版社，2005：230.

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[4]LiliWang，XiaoZhang，YipingWang，eta1.Simultaneousdeterminationofpreservativesinsoftdrinks，yogurtsandsaucesbyanovelsolid-phaseextractionelementandthermaldesorption-gaschromatography[J].AnalyticaChimicaAeta，2006，577(1)：62-67.

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EffectofdifferentfermentationstrainsontotalisoflavonecontentandProteaseactivityinsemensojaepraeparatum

YANGDan1，WANGHongli2，MADanning1，WANGYannian2*

(1.Shenyangpharmaceuticaluniversity，Shenyang110016,China；2.ShenyangvicahusbandryandtechnologyCo；Ltd，Shenyang110143,China)

Objective：A UV spectrophotometry used for determination of semen sojae praeparatum isoflavones was established.The effects of different fermentation strains on the content of total isoflavones and protease activity in the fermentation products was studied.Methods：Genistein was selected as the reference substance.Contents of the isoflavones in black bean and semen sojae praeparatum by natural fermentation，Aspergillus oryzae fermentation，Aspergillus niger fermentation at the maximum absorption peak.Folin method was used for determination of protease activity.Results：The total content of isoflavones in black bean was7.77mg·g-1，natural fermentation products was8.08mg·g-1，Aspergillus oryzae fermentation products was8.87mg·g-1，Aspergillus Niger fermentation products was10.99mg·g-1，average recovery was100.09%，100.34%，99.76%，99.87%，and the RSD was1.10%，1.28%，1.22%，1.24%.The enzyme activity of black beans was190.7U·g-1，natural fermentation products was309.4U·g-1，Aspergillus oryzae fermentation was474.9U·g-1，Aspergillus Niger fermentation was500.0U·g-1.Conclusion：UV method as a means of inspection semen sojae praeparatum isoflavone content with easy—to—handle，good accuracy and reproducibility.The single strain fermentation of semen sojae praeparatum，in enzyme activity and isoflavone content respects，were higher than the natural fermentation products and black bean.

Semen sojae praeparatum；Total isoflavones；Aspergillus oryzae；Aspergillus niger

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.006

2016-03-22)

国家中医药管理局中医药行业专项“六神曲等7种中药发酵技术及规范化应用研究”(任务编号：201507004-03)

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王延年，副教授，硕士生导师；研究方向：中药炮制机理及中药材质量控制研究/中药活性化学成分研究/中药发酵机理及新型饮片研究；Tel：13998277936，E-mail：3a4n@sina.com