周生飞 詹怀宇 姚向荣 付时雨

（华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510640）

漆酶/天然介体体系是一种对环境友好的生物反应体系，在制浆造纸中有着重要的应用。在二次纤维回用中，它有助于废纸脱墨，提高脱墨浆的可漂性，同时提高纸浆的裂断长和撕裂指数；在高得率制浆中，它能显著降低能耗，提高成纸强度；在化学法制浆中，它能降低纸浆卡伯值，提高白度；在纸浆漂白中，它能取代传统的含氯漂白，降低有毒和致癌物质的排放量，减少对环境的污染和人类的危害；在造纸废水处理中，它能降解造纸废水中的有毒物质和有色物质。此外，它还能用于改善纸浆纤维性能，提高纸张湿强度等［1］。

笔者曾用羟基苯甲酸、香草酸、对羟基苯甲醛、丁香酸、香草醛、丁香醛、乙酰丁香酮等7种小分子酚醛物质及它们的混合物作为漆酶/介体体系的天然介体，用于硫酸盐法竹浆的漆酶/介体体系漂白，这些体系都能不同程度地促进竹浆最终白度的提高和木素的脱除。然而，漆酶/天然介体体系的漂白机理至今仍不十分明确，很有必要继续深入探讨。本实验对硫酸盐竹浆进行了包含漆酶/天然介体体系漂白段的全无氯漂白，并对各段的残余木素进行了GPC、TGA、FT-IR、1H-NMR和13C-NMR分析，期望通过漆酶/天然介体体系漂白段前后竹浆残余木素的表征，探索漆酶/天然介体体系的漂白机理。

1 实验

1.1 原料和药品

硫酸盐竹浆，初始卡伯值16.0、白度30.3％。

主要药品和试剂：漆酶（通过实验室培养的白腐菌获得），混合纤维素酶（由CMC酶和Avicel酶组成，液体，夏盛公司提供），吡啶（分析纯），醋酸酐（分析纯），THF（色谱纯），KBr（光谱纯），无水乙醇（分析纯），DMSO-d6（含TMS）。

1.2 竹浆的TCF漂白

首先对竹浆进行了TCF漂白，漂序为O-LMS-QP，具体操作条件如下。

氧脱木素（O）：在旋转式反应釜中进行，浆浓10％，NaOH用量4.0％，MgSO4用量0.5％，氧压0.5MPa，温度100℃，时间60min。

漆酶/天然介体体系处理（LMS）：在PARR 4843高压反应釜中进行，所用天然介体为对羟基苯甲酸、香草酸、对羟基苯甲醛、丁香酸、香草醛、丁香醛、乙酰丁香酮等小分子酚醛物质的混合物，浆浓10％，漆酶用量5IU/g，介体用量2％，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节pH值为4.0，温度50℃，氧压0.5MPa，反应时间120min，搅拌转速150r/min。

螯合处理（Q）：将浆料及化学品密封于塑料袋内，揉搓均匀后置于恒温水浴锅中，浆浓10％，ED-TA用量1.0％，漂终pH值3.0，温度70℃，反应时间60min。

过氧化氢漂白（P）：将浆料及化学品密封于塑料袋内，揉搓均匀后置于恒温水浴锅中，浆浓10％，H2O2用量3.0％，NaOH用量2.0％，MgSO4用量0.05％，EDTA用量0.2％，温度90℃，反应时间150min。

1.3 漂白各段竹浆残余木素的提取

首先用温和的酶水解-酸水解法［2］从竹浆中制备粗木素，然后用乙醚对粗木素进行提纯。

温和的酶水解：将湿润的竹浆置于三角瓶中，加入一定量的去离子水，浆浓约为3％；加入pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使浆中离子浓度为50mmol/L；加入混合纤维素酶，用量为50FPU/g（绝干浆），然后将三角瓶置于50℃的摇床内，在200r/min下振荡，24h后再次加入酶液，总反应时间为48h。反应结束后，将混浊液在4500r/min下离心10min，得到沉淀。

酸水解：将酶水解得到的沉淀加入到0.05mol/L HCl的二氧六环-水（前者与后者体积比85∶15，下同）中，在通N2保护的情况下微沸（103℃左右，油浴）回流2h；反应液冷却后用G2玻璃滤器过滤，残留固体用二氧六环-水洗涤至无色，合并滤液，在强烈搅拌下用NaHCO3中和；然后将液体缓慢滴入大量pH值为2的水中（水体积是液体体积10倍以上），出现淡黄色沉淀；在4500r/min下离心10min，得到沉淀，用一定体积的二氯甲烷洗涤3次后，冷冻干燥，制得粗木素。

粗木素提纯：将粗木素溶于二氧六环-水中，然后缓慢滴入大量乙醚（10倍体积以上）中，出现淡黄色沉淀；在4500r/min下离心10min，得到沉淀，用乙醚洗涤，冷冻干燥，得到纯化木素。

1.4 木素的乙酰化

将纯化木素置于带塞的三角瓶中，加入足量的吡啶和醋酸酐（前者与后者体积比1∶2），用N2排出三角瓶中的空气，置于暗中反应72h，反应期间不定期振荡。反应结束后，将液体缓慢滴入大量乙醚（10倍体积以上），析出浅黄色的沉淀，即为乙酰化后的木素。离心分离，并用乙醚洗涤乙酰化后的木素至无吡啶味，冷冻干燥备用。

1.5 对木素的分析

木素的分子质量分布在Agilent 1200 series上进行测定，2根凝胶色谱柱为Agilent PL gel 5μm 103Å和500Å，RID检测器，流量1.0mL/min柱温30℃，标线用聚苯乙烯作出，其质均相对分子质量为1490～53500。

木素的TGA分析在TGA Q 500上进行，升温速率为20℃/min。

木素的FT-IR分析在Bruker Tensor 27上进行，采用KBr压片法，扫描次数为16次。

木素的1H-NMR分析和13C-NMR分析是先将乙酰化的木素溶于DMSO-d6（含TMS）中，然后在Bruker AV400 NMR上进行。

2 结果与讨论

2.1 竹浆木素的GPC分析

漂白各段竹浆残余木素的GPC分析结果如表1所示。由表1可知，经O段处理后，残余木素的质均分子质量略有增加，而经LMS段处理后，残余木素的质均分子质量明显变小，说明残余木素在漂白过程中的总体变化趋势是质均分子质量变小。残余木素分子质量分布经O段处理后，多分散性变小，说明分子质量分布变窄；经LMS段处理后，残余木素的分子质量分布反而变得更为分散。

表1 漂白各段竹浆残余木素的相对分子质量

2.2 竹浆木素的TGA分析

O段和LMS段残余木素的热重（TG）曲线及微分（DTG）曲线见图1。

图1 O段/LMS段残余木素的TG和DTG曲线

由图1a可知，O段残余木素的热解过程分为3个区段：温度＜210℃时，微分曲线在200.3℃处出现第一个失重峰，主要是样品中所含水分的去除；在210～600℃范围内，木素发生明显热解，微分曲线在338.2℃处有较大失重峰，这个峰区间为木素的主要热解阶段，木素失重达56.2％，600℃处木素的残余质量为31.6％；温度＞600℃，热重曲线平缓，微分曲线在650℃附近出现小的失重峰，为木素的二次热解。

由图1b可知，LMS段残余木素的热解过程也分为3个区段：温度＜159.5℃时，微分曲线在139.1℃处出现一个失重峰，主要是样品中所含水分的去除；159.5～600℃为木素热解的主要区间，木素发生明显热解，微分曲线在194℃处有一个失重峰肩，在245.3℃和335.1℃处有2个主要的失重峰；木素在159.5～298℃峰区间的失重为22.9％，在298～600℃峰区间的失重为25.8％，600℃处木素的残余质量为34.1％；温度＞600℃，热重曲线平缓，微分曲线无失重峰。

综上所述，在LMS段处理前后，竹浆残余木素的热解行为明显不同。LMS段前残余木素仅在338.2℃处有一主要的失重峰，LMS段后残余木素除了在该处附近的335.1℃处有一个主要的失重峰外，还在较低温度245.3℃处出现一个更大的失重峰。可见，经LMS段后，竹浆残余木素的热稳定性变差，更易在较低温度下热解。

2.3 竹浆木素的FT-IR分析

图2为LMS段残余木素的FT-IR，各个吸收峰根据参考文献［3-9］确定，其归属见表2。

图2 LMS段残余木素的FT-IR

表2 竹浆残余木素FT-IR吸收峰的归属

3470cm-1说明原浆木素、O段和LMS段残余木素中均存在一定量的游离脂肪族羟基；3130cm-1说明原浆木素和LMS段残余木素中存在游离酚羟基，而O段残余木素中几乎没有游离酚羟基；3080cm-1说明O段残余木素中有少量—COOH。对于原浆木素和LMS段残余木素，3130cm-1比3470cm-1强，说明游离酚羟基比脂肪族羟基多。2940cm-1附近为CH3、CH2、CH的C—H伸缩振动，原浆木素和LMS段残余木素在此处的吸收类似，但是O段残余木素的CH3吸收显著减弱，说明O段中大量的—OCH3被脱除。1767cm-1为芳香乙酰基，1718cm-1为脂肪乙酰基，原浆木素在1767cm-1处有大的吸收峰，说明原浆木素中主要为酚羟基，脂肪族羟基少；O段残余木素在1743cm-1有大的吸收峰，处于1767～1718cm-1之间，说明乙酰化的酚羟基和脂肪族羟基的含量相当，结合3130cm-1处无游离酚羟基，说明O段残余木素脂肪族羟基比酚羟基稍多；LMS段残余木素在1743cm-1处有大的吸收峰且峰肩向1767cm-1延伸，说明LMS段残余木素以脂肪族羟基为主。综上所述，原浆木素羟基以酚羟基为主，O段残余木素中脂肪族羟基比酚羟基稍多，而LMS段残余木素则以脂肪族羟基为主，说明木素在O段和LMS段中，苯环被持续破坏，导致酚羟基减少，脂肪族羟基增多。

1685～1652cm-1为共轭CO的吸收，1685cm-1为共轭醛CO，1652cm-1为共轭酮CO；原浆木素中1685cm-1处和1652cm-1处的吸收相当，O段残余木素相对原浆木素在1652cm-1处的吸收增强，LMS段残余木素相对O段残余木素在1685cm-1处的吸收又增强，说明漂白过程中木素先生成共轭酮，然后又生成共轭醛。

对于原浆木素，在1465～1458cm-1、1418cm-1、1400cm-1处为愈创木基（G）上—OCH3的C—H弯曲振动，在1385cm-1、1372cm-1、1338～1331cm-1处为紫丁香基（S）上—OCH3的C—H弯曲振动；原浆木素中G单元—OCH3的吸收比S单元—OCH3的吸收略强，可得G与S的摩尔比大于2∶1，即S单元占木素结构单元的比例不到1/3（以物质的量计），竹子原浆木素的主要结构单元为G单元。

对于LMS段残余木素，在1465～1455cm-1、1419cm-1、1400cm-1处为G单元上—OCH3的C—H弯曲振动，在1385cm-1、1372cm-1、1333cm-1处为S单元上—OCH3的C—H弯曲振动；G单元的吸收比S单元稍弱，可得G与S的摩尔比小于2∶1，G单元仍为主要结构单元，但S单元占木素结构单元的比例相对原浆木素稍多，即经LMS段后，残余木素中S单元的含量增多。

在1045cm-1处为CC—O的C—O，在1013cm-1处为Ar-O的C—O，原浆木素和O段残余木素在该两处的吸收类似，LMS段残余木素在1045cm-1处吸收比原浆木素和O段残余竹浆木素强，而在1013cm-1处变弱，说明LMS段中，木素苯环被破坏，苯环转变成脂肪链。

2.4 竹浆木素的1H-NMR分析

图3 O段/LMS段残余木素的1H-NMR图

表3 O段/LMS段残余木素1H-NMR谱共振峰的归属

O段和LMS段残余木素的1H-NMR图如图3所示，图3中各峰的归属根据参考文献［8-12］确定（见表3）。由表3可知，8#～13#峰为苯环质子的共振，5#～7#峰为—OCH3的质子共振。由8#～13#峰可知，这2种木素中都含有愈创木基（G）、紫丁香基（S）和对羟基苯基（H）这3种苯丙烷结构单元，LMS段前后竹浆残余木素为GSH型。1#峰和2#峰为脂肪乙酰基，3#峰为芳香乙酰基，O段残余木素中，1#峰和2#峰积分面积之和与3#峰积分面积之比为2.5∶1，LMS段残余木素中，它们的积分面积之比为3∶1，说明经LMS段后，脂肪乙酰基增多，即残余木素中脂肪族羟基增多，这是由于经LMS段后竹浆残余木素的破坏增多。5#峰为脂肪链—OCH3，6#峰和7#峰为苯环—OCH3，O段残余木素中以7#峰为主，而LMS段残余木素中以5#峰为主，说明LMS段残余木素中脂肪链—OCH3比O段残余木素的多、苯环—OCH3比O段残余木素的少，这是由于LMS段中木素破坏增加。

图4是O段和LMS段残余木素苯环质子区的比较，从O段到LMS段，代表G单元和S单元的峰的面积之比G/S和G’/S’均变大，说明经LMS段后，竹浆残余木素S单元相对含量增多；H/G和H’/G’之比均变小，说明经LMS段后，竹浆残余木素H单元相对含量减少。可见，漆酶/天然介体体系漂白对竹浆木素S单元的破坏较少，而对H单元的破坏和去除则较多。

图4 O段/LMS段竹浆残余木素1H-NMR的苯环质子区

对1H-NMR谱的相关区域进行积分，可以由积分面积计算出竹浆残余木素中主要基团的摩尔比，如表4所示。经LMS段后，残余木素每个苯丙烷单元对应的甲氧基数增多，这是因为在LMS段中部分苯环被破坏后残留在竹浆中，导致苯环数量减少，然而甲氧基却仍然保留；苯丙烷单元对应的脂肪族羟基显著增加，也说明LMS段中木素的苯环被进一步氧化破坏。

表4 木素中各基团的摩尔比

2.5 竹浆木素的13C-NMR分析

LMS段前后竹浆残余木素的13C-NMR谱如图5和图6所示，各峰的归属根据参考文献［4-5，9，11-15］确定（见表5）。

如图5所示，对于O段残余木素，1#峰为脂肪乙酰基的CO，2#峰为芳香乙酰基的CO，前者与后者的积分面积之比大于1，可见，在O段残余木素中，同时存在脂肪族羟基和酚羟基，脂肪族羟基的含量比酚羟基多。3#峰为酯化紫丁香基（S）的C-3和C-5的共振，4#峰为愈创木基（G）的C-3的共振，6#峰为愈创木基（G）的C-4的共振，7#峰为对羟基苯基（H）的C-4的共振，说明O段残余木素为GSH型，由3#峰、6#峰与7#峰的积分面积比为1∶2∶1可得，苯丙烷单元S、G、H的摩尔比为0.5∶2∶1（3#峰由2个C的共振产生，而6#峰和7#峰由1个C的共振产生），即O段残余木素以G单元为主，H单元含量多于S单元含量，说明在O段中—OCH3被大量脱除。

如图6所示，在LMS段残余木素中，1#峰与2#峰积分面积之比为1∶0.07，比值远远大于1，可见，同时存在脂肪族羟基和酚羟基，且以脂肪族羟基为主，酚羟基非常少。3#峰～7#峰、9#峰～11#峰为苯环C的共振，可知LMS段残余木素为GSH型。由化学位移为143.6（H）、148.0～149.7（G）、152.6（S）处的积分得，H、G、S的摩尔比为1∶4.94∶2.78。可见，LMS段残余木素以G为主；相对于O段残余木素，LMS段残余木素S单元增加，H单元减少，与前文FT-IR和13C-NMR的分析结果一致。

从图6的化学位移为75.3、63.2、62.0、60.7和59.3可知，木素单元之间的连接方式主要有β-1’，β-O-4’和β-5’，它们的积分面积比为1∶2.38∶0.26，则β-1’、β-O-4’和β-5’3种主要连接方式的摩尔分数（只考虑这3种连接时）依次为27.5％、65.4％、7.1％。在Sakakibara提出的由28个苯丙烷单元构成的针叶木木素的结构模型中，以β-O-4’连接为主，且有3个β-1’和4个β-5’连接；而Nimz提出的由25个苯丙烷单元构成的阔叶木木素模型中，β-1’连接为3个，β-5’连接仅有2个［16］。竹子作为禾本科植物，除以β-O-4’为主的连接外，还有较多的β-1’连接，而β-5’连接较少，这是合理的。

表5 LMS段前后竹浆残余木素13C-NMR谱中各峰归属

综上所述，竹浆残余木素中脂肪族羟基多于酚羟基，LMS段残余木素酚羟基很少。竹浆木素为GSH型，结构单元以G单元为主，O段残余木素中G＞H＞S（以物质的量计，下同），LMS段残余木素中G＞S＞H，说明经LMS段后，竹浆木素中S单元增多。苯丙烷单元之间的连接以β-O-4’为主，且有β-1’和β-5’连接，经LMS段后，竹浆木素中β-1’连接的含量增加，而β-5’连接很少。经LMS段后，竹浆残余木素的破坏加剧，脂肪族羟基增加，H单元的含量减少，G单元的含量略有减少，S单元的含量从27％增至31.9％。

3 结论

3.1 采用GPC分析了硫酸盐竹浆木素、O段和LMS段的残余木素。结果表明，原浆木素的质均相对分子质量为11010、O段残余木素的为12150、LMS段残余木素的为7374，多分散性依次为1.49、1.03和2.38，可见，随漂白（O、LMS）的进行，竹浆残余木素的总体变化趋势为分子质量降低。

3.2 采用TGA分析了O段和LMS段残余木素。结果表明，O段残余木素在338.2℃处有1个主要的失重峰，而LMS段残余木素在335.1℃处和245.3℃处有2个主要的失重峰。可见，经LMS段处理后，竹浆残余木素的热稳定性变差，更易在较低温度下热解。

3.3 采用FT-IR和1H-NMR分析了原浆木素、O段和LMS段残余木素。采用13C-NMR分析了O段和LMS段残余木素。结果表明，竹浆木素为GSH型，结构单元以G为主，苯丙烷单元之间的连接以β-O-4’为主，此外还有β-1’和β-5’连接。原浆木素中，羟基以酚羟基为主，苯丙烷单元中S的含量（以物质的量计，下同）少于1/3；O段残余木素中，脂肪族羟基比酚羟基多，并有少量—COOH、—OCH3脱除，苯丙烷单元中G＞H＞S；LMS段残余木素中，羟基以脂肪族羟基为主，S单元含量增加，H单元含量减少，β-1’连接增加，β-5’连接减少。综上所述，随漂白（O、LMS）的进行，—OCH3被脱除，苯环被破坏，脂肪族羟基增多；经LMS段后，竹浆残余木素中S单元增加，H单元减少。

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