张献

广西中医药大学，广西南宁 530000

纳米孔技术检测蛋白质的研究新突破

张献

广西中医药大学，广西南宁 530000

目的 探讨纳米孔技术检测蛋白质的研究新突破。方法 应用氮化硅材料纳米孔芯片，初步研究金纳米棒及BSA易位行为，建立应用纳米孔检测纳米颗粒样品及蛋白质生物分子样品方法，统计分析纳米颗粒的易位信号及蛋白质分子信号；按照实验所获得的易位信号，总结常见的易位信号类型；按照实验结果模拟固态纳米孔内电场及纳米孔周围电场，获得不同电压下同一纳米孔的电场强度比较。结果 实验选择孔径为78 nm的固态纳米孔检测蛋白质BSA，将溶于1M KCl溶液内的样品，加入至流体内，偏置电压变换获得BSA分子过孔信号图；选择76 nm的纳米孔在980 mV、900 mV、400 mV电压下检测12 nm的蛋白质BSA分析易位结果，易位事件的原始信号如图2；400 mV电压下纳米孔与蛋白质的相互作用较强，易位事件相对较为分散，而980 mV及900 mV电压下，纳米孔与蛋白质分子的作用时间较短，分子过孔速度较快，出现的易位事件也较多；激发波长为280 nm时，BSA在自然折叠态时内源荧光发射峰的最大发射波长位于346 nm附近，说明色氨酸残基部分被隐藏；随着尿素浓度的升高，BSA的相对荧光强度逐渐下降，出现荧光猝灭现象，说明BSA及尿素发生作用，导致BSA变性，但在0～5 M时，蛋白质出现部分变性，6 M后，峰值出现显著红移，BSA完全变性；蛋白质BSA和经尿素变性后的BSA易位原始信号图：BSA加入后，电流基线较波动，后出现易位信号，蛋白质易位时间的长短，与BSA与孔的作用及蛋白质结构密切相关；加入经尿素变性的BSA后，电流基线总体稳定但变细，易位信号峰顶端较尖。结论氮化硅纳米孔检测蛋白质应用为后续的纳米孔传感器在蛋白质研究中提供理论及实验基础。

实验研究；信号检测；BSA；固态纳米孔

随着近年来纳米孔检测技术的飞速发展，固态纳米孔因其尺寸极易掌握，且其稳定性较佳，是科学研究的热点内容，但对于检测蛋白质等生物大分子和变性剂与蛋白质的相互作用关系研究则较少[1]。鸟叔是蛋白质变性剂的常见类型之一，可促使蛋白质变性，有助于蛋白质的解折叠及折叠机制进行了解；血清白蛋白主要进行PH值及血液渗透压的调节，同时可运送类固醇、氨基酸、脂肪酸等多种物质[2]。牛血清蛋白是体积较大的球蛋白，其水溶性将，可用于研究蛋白质变性机制。本研究探析应用固态纳米孔检测技术研究经尿素变性的BSA及BSA的易位行为，效果满意，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料

中国电子集团第55研究所制备纳米孔芯片、氮化硅薄膜，南京大学固体微结构国家重点实验室的聚焦粒子束加工系统完成刻蚀纳米孔；在pH7.0的PBS溶液内溶解BSA白色粉末，获得BSA样品溶液，检测前在已过滤的1M氯化钾溶液内稀释样品溶液，配制成检测工作液，分成小份，在-20°C冰箱内置存，另取工作液加入已过滤的尿素6 M，待变性后为另一检测液；超纯水中溶解尿素粉末，配制出0 M、1 M、2 M、3 M、4 M、5 M、6 M、7 M、8 M浓度的溶液，与相同浓度的蛋白质相互作用，为紫外荧光检测的溶液；氯化钾7.45 g在100 mL超纯水内溶解，配制为1 mol/L的氯化钾溶液，实验前应用0.02 μm滤膜过滤；聚二甲基硅烷PDMS、乙醇、30%双氧水溶液500 uL加入试管内，加入浓硫酸1500 uL，混匀充分。

1.2 主要实验仪器

电位粒度分析仪（N4PLUS）、荧光光谱仪。水浴锅、氮气瓶 （流体和干燥芯片）、Anotop0.02 um滤膜（Whatman）、Ag/AgCl自制电极，自制微流体装置，自制屏蔽箱（屏蔽特性：130×85×65 cm3＞60 dB），膜片钳放大器（Axopatch 700 B）。

1.3 实验方法

①制备芯片：热氧化硅晶圆后在上下两面生长约100 nm厚的二氧化硅薄膜，低压气象化学沉积法（LPCVD）在两面分别沉积500 nm及100 nm厚的氮化硅薄膜，光刻胶涂于500 nm厚的氮化硅面，曝光后予以反应离子刻浊（RIE），形成500 um×500 um的正方形窗口；氢氟酸湿法进行腐蚀，至表面氮化硅层停止，形成100 nm厚的自支撑氮化硅薄膜，应用聚焦粒子束加工系统予以打孔，按照粒子束大小和打孔时间评估纳米孔孔径的制备大小情况；②芯片表征：检测氮化硅薄膜是否完整，表征方法暴露制备伏安特性曲线及显微镜下观察评估纳米孔的电化学特性；③实验前处理流体及芯片：离心管加满2 mL超纯水，将芯片放入后初洗，后放入新配置的1.2 mL食人鱼溶液的玻璃烧杯内，90°C水浴内放入烧杯30 min，烧杯取出，自然冷却至室温，后取出芯片，应用大量超纯水冲洗，芯片冲洗后放入装有超纯水的离心管内置存备用；每次应用前应用吸水纸水分吸干或氮气吹干；超纯水彻底清洗PDMS密封垫片及流体装置，超声清洗30 min，氮气吹干；④配制不同浓度的KCl电解液及样品溶液：超纯水中溶解蛋白质BSA粉末配制为1 mM的样品溶液，根据需要稀释至50 nM、100 nM、500 nM、1 uM、2 uM、5 uM、10 uM、50 uM、100 uM、500 uM等不同浓度，分装为小份在-20°C下置存；配制KCl浓度为1M电解质溶液，根据需要稀释至浓度为0.1 M及0.4 M，过滤备用；⑤组装检测装置：在PDMS密封垫上放置纳米孔芯片，左右流体部分放入铝制模具内，螺栓旋紧固定；为避免加样过程中出现气泡，PDMS胶固定两根特氟龙软管，1 mL注射器插入特氟龙软管内部加样；⑥检测样品易位信号及分析：样品溶液加完后，将一对Ag/AGCl自制电极放入两根特氟龙软管内，流体装置放入大屏蔽箱内，电极另一端接好膜片钳放大器探头，注意电极对应；施加电压后，膜片钳放大电流信号，经由数据采集卡显示于上位机显示屏。偏置电压，样品浓度改变，改变湿度、温度、电解液KCl浓度改变纳米孔对蛋白质BSA检测调节，得到蛋白质BSA过孔信号。应用膜片钳自带软件Clampfit0.3分析记录数据。

2 结果

2.1 易位信号的统计分析

实验选择孔径为78 nm的固态纳米孔检测蛋白质BSA，将溶于1M KCl溶液内的样品，加入至流体内，偏置电压变换获得BSA分子过孔信号图（图1）；选择76 nm的纳米孔在980 mV、900 mV、400 mV电压下检测12 nm的蛋白质BSA分析易位结果，易位事件的原始信号如图2；400 mV电压下纳米孔与蛋白质的相互作用较强，易位事件相对较为分散，而980 mV及900 mV电压下，纳米孔与蛋白质分子的作用时间较短，分子过孔速度较快，出现的易位事件也较多。

图1 固态纳米孔检测蛋白质BSA分子 a：装置示意图；b：I-V曲线；c：过孔信号图

图2 蛋白质BSA不同电压下易位信号统计分析a：电流变化幅值-易位时间散点图；b：易位事件-标准事件数柱状图；c：阻塞电流-标准事件数柱状图

2.2 蛋白质BSA与尿素相互作用的荧光光谱分析

激发波长为280 nm时，BSA在自然折叠态时内源荧光发射峰的最大发射波长位于346 nm附近，说明色氨酸残基部分被隐藏；随着尿素浓度的升高，BSA的相对荧光强度逐渐下降，出现荧光猝灭现象，说明BSA及尿素发生作用，导致BSA变性，但在0～5 M时，蛋白质出现部分变性，6 M后，峰值出现显著红移，BSA完全变性，见图3。

图3 不同浓度尿素与蛋白质BSA相互作用的荧光光谱图

2.3 经尿素变性后蛋白质BSA的固态纳米孔检测结果分析

蛋白质BSA和经尿素变性后的BSA易位原始信号图（图4）：BSA加入后，电流基线较波动，后出现易位信号，蛋白质易位时间的长短，与BSA与孔的作用及蛋白质结构密切相关；加入经尿素变性的BSA后，电流基线总体稳定但变细，易位信号峰顶端较尖。

图4 固态纳米孔检测经尿素变性后的BSA及BSA原始信号及单个易位信号

3 讨论

每个新制备成的氮化硅纳米芯片均需经过电学特性的表征及观察电子显微镜，因在预处理及制备芯片的过程中，薄膜极易出现破裂，在实验过程前如无法较佳的检测到芯片薄膜的完整性而直接应用于实验，可引发安装芯片后发生电流过载[3]；蛋白质与各种形式的生命及生命活动密切相关，它是生命的物质基础[4]；机体的每个细胞全部重要组成部位均有蛋白质的参与；蛋白质的空间结构较复杂，有一级结构、二级结构、三级结构、四级结构，蛋白质由一级结构向更高级的结构转变方式主要是蛋白质折叠，如蛋白质出现折叠错误会严重影响机体的功能[5]，因此，检测蛋白质及分析其结构十分重要。目前，检测蛋白质结构的方式有多种，如X射线晶体学，痛感检测蛋白质分子在晶体中电子密度的空间分布评估蛋白质中所有原子的三维坐标[6]；对于已知蛋白质结构的检测还可通过圆二色谱及核磁共振等方式，但操作方法较为复杂，检测成本较高；纳米孔计数为新型单分子检测热点，可应用于高灵敏度的蛋白质检测[7]。

本研究探析纳米孔技术检测蛋白质的研究新突破，结果显示：实验选择孔径为78 nm的固态纳米孔检测蛋白质BSA，将溶于1M KCl溶液内的样品，加入至流体内，偏置电压变换获得BSA分子过孔信号图；选择76 nm的纳米孔在980 mV、900 mV、400 mV电压下检测12 nm的蛋白质BSA分析易位结果，易位事件的原始信号如图2； 400 mV电压下纳米孔与蛋白质的相互作用较强，易位事件相对较为分散，而980 mV及900 mV电压下，纳米孔与蛋白质分子的作用时间较短，分子过孔速度较快，出现的易位事件也较多；激发波长为280 nm时，BSA在自然折叠态时内源荧光发射峰的最大发射波长位于346 nm附近，说明色氨酸残基部分被隐藏；随着尿素浓度的升高，BSA的相对荧光强度逐渐下降，出现荧光猝灭现象，说明BSA及尿素发生作用，导致BSA变性，但在0～5 M时，蛋白质出现部分变性，6 M后，峰值出现显著红移，BSA完全变性；蛋白质BSA和经尿素变性后的BSA易位原始信号图：BSA加入后，电流基线较波动，后出现易位信号，蛋白质易位时间的长短，与BSA与孔的作用及蛋白质结构密切相关；加入经尿素变性的BSA后，电流基线总体稳定但变细，易位信号峰顶端较尖，与范勇等[8]的研究结果大体一致，纳米孔测序为近年来飞速发展的测序技术之一，纳米孔是在薄膜上组装或制备的纳米级空隙，尺寸约在0.1～0.01纳米量级之间，其基本检测原理为含有纳米孔的薄膜将一定pH值及一定浓度的电解质 （常为氯化钾溶液）分为两部分，电解质溶液中溶解待检测样品，在两个腔室间施加电场，电场经由纳米形成一定的开孔粒子电流，在电场的作用下，带电颗粒由一端腔内穿过纳米孔，迁移至另一端腔室[9-10]；在穿孔时，因样品颗粒会占据部分纳米孔空间，原来可通过纳米孔的部分离子无法通过，引发开孔离子电流急骤降低，出现了阻塞电流；即为检测了样品颗粒的易位事件；在理想的状态下，因各种检测样品的结构及尺寸具有一定的差异，在穿孔过程中对孔的阻塞程度也会有所不同，检测到的阻塞电流大小也不同，可反映出样品颗粒的表面性质、形状、大小等特征属性；牛血清蛋白主要由一个自由半胱氨酸基团、17个二硫键、607个氨基酸残基组成，是较大的螺旋形结构；其氨基酸较多可用于电离，同时水溶性又较高，可用于研究蛋白质的变性机制；样品加入电解质溶液中后，基线电流开始出现一些尖峰，每个尖峰对应一个蛋白质BSA分子的易位事件；固态纳米孔检测1 M氯化钾样品溶液中3 uM BSA分子的直径大小约为12 nm，荧光光谱分析蛋白质BSA的完全变性时的尿素浓度，即6 M浓度尿素对蛋白质变性可完全变性；而电压较小时，纳米孔孔壁与蛋白质的相互作用时间较长，出现的易位事件不多，阻塞电流也相对较小；随着电压的升高，蛋白质与孔壁的作用时间越短，在高压时也出现可相应结构改变，阻塞电流相应增大，偏置电压的大小对周围区域及孔的电场产生影响，进而影响易位过程。综上所述，氮化硅纳米孔检测蛋白质应用为后续的纳米孔传感器在蛋白质研究中提供理论及实验基础。

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