孟 涛，苗盼盼，纪玉青，牛 勇，宾 萍，戴宇飞，郑玉新（中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，化学污染与健康安全重点实验室，北京100050）

利用原代肝细胞模型检测细胞内磷酸化组蛋白H2AX表达筛选遗传毒物的方法验证

孟 涛，苗盼盼，纪玉青，牛 勇，宾 萍，戴宇飞，郑玉新
（中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，化学污染与健康安全重点实验室，北京100050）

目的 验证以原代小鼠肝细胞为受试细胞，以细胞内磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）表达改变为检测指标的体外检测化学物遗传毒性的实验方法。方法 采用改良的两步胶原酶灌注法分离获取小鼠肝细胞，并运用三明治法体外培养肝细胞。选择4种已知的遗传毒物平阳霉素、苯并芘、苯乙烯和氧化苯乙烯及2种非遗传毒物硫唑嘌呤和环孢素A作为受试物，用受试物0～40 μmol·L-1处理原代培养肝细胞0～24 h，CCK-8法检测细胞毒性，并用流式细胞术检测γH2AX的表达水平。结果 利用所建立的方法筛选上述4种遗传毒物均获得阳性结果，2种非遗传毒物均呈阴性反应。直接遗传毒物平阳霉素和氧化苯乙烯作用3 h，间接遗传毒物苯并芘和苯乙烯作用6 h时，γH2AX表达量最高（P＜0.01）。4种遗传毒物处理组在最适时间点（直接遗传毒物：3 h；间接遗传毒物：6 h）及最适作用浓度（10 μmol·L-1）诱发细胞γH2AX的表达水平依次为25.7，18.4，12.4和14.2（平均荧光强度），分别为DMSO溶剂对照组的18，12，8和10倍（P＜0.01），且γH2AX的表达水平与遗传毒物浓度呈显著正相关（P＜0.01）。非遗传毒物硫唑嘌呤和环孢素A处理组与DMSO溶剂和空白对照组相比，γH2AX的水平均无明显变化。……