李银英，陈成群，张振中

1)郑州大学第二附属医院药学部 郑州 450014　2)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052　3)郑州大学药学院 郑州450001



2-甲氧基雌二醇联合冬凌草甲素对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响*

李银英1)，陈成群2)，张振中3)#

1)郑州大学第二附属医院药学部 郑州 4500142)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 4500523)郑州大学药学院 郑州450001

2-甲氧基雌二醇；增殖；凋亡；胃癌；联合用药；SGC-7901细胞

目的：研究2-甲氧基雌二醇(2-ME)单独和联合冬凌草甲素对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法：用0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L 2-ME处理SGC-7901细胞24、48和72 h后，观察细胞形态变化，SRB法检测2-ME对SGC-7901细胞增殖的抑制作用；用0.625、2.500、10.000、20.000 μmol/L 2-ME以及相同浓度的冬凌草甲素单独或联合应用处理SGC-7901细胞48 h后，计算结合指数，用流式细胞术和荧光染色法观察细胞凋亡情况。结果：2-ME作用于SGC-7901细胞48 h的IC50值为5.31 μmol/L，对细胞SGC-7901的抑制作用呈时间依赖性,与冬凌草甲素联合应用的IC50值为8.46 μmol/L。不同浓度2-ME作用48 h，随着剂量增加，SGC-7901细胞凋亡率增加，联合应用冬凌草甲素对细胞凋亡的影响未表现出协同作用。结论：2-ME可以抑制SGC-7901细胞的增殖，诱导其凋亡，与冬凌草甲素联合应用时对肿瘤细胞增殖的抑制表现为相加作用，对凋亡未表现出协同作用。

恶性肿瘤是当今社会严重威胁人类生命的主要因素之一，传统的化学药物治疗毒性大，疗效差，研究发掘高效低毒的治疗药物和方法成了近期人们关注的焦点。2-甲氧基雌二醇(2-methoxy estradiol,2-ME) 是雌二醇在体内的生理代谢产物[1-2]，广泛存在于人类血液和尿液中，能选择性杀伤肿瘤细胞，对正常细胞基本没有毒性以及对雌激素受体无依赖性。2-ME得到了国内外学者的广泛研究，目前正在进行多种肿瘤治疗的临床试验，是一种很有前景的抗肿瘤药物。冬凌草甲素是从冬凌草等植物叶子中提取出的一种贝壳杉烯二萜类化合物，具有较好的抗肿瘤活性。研究[3-4]证实2-ME可以将肿瘤细胞阻滞在G2/M期。而冬凌草甲素也能通过将肿瘤细胞阻滞于G2/M期而达到抗增殖的作用[5]，作者考虑二者联合用药可能有相加作用。该研究以胃癌SGC-7901细胞为研究对象，初步考察了2-ME与冬凌草甲素单独和联合用药对SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。

1　材料与方法

1.1主要试剂2-ME(由郑州大学药学院新药合成课题组自制，纯度>99%)，以二甲基亚砜(DMSO)配制成64 mmol/L的原药储备液，0.22 μm滤器除菌，4 ℃保存，临用时用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释成所需浓度；冬凌草甲素(购自北京鼎国昌盛生物技术公司，纯度﹥99%)，以DMSO配制成64 mmol/L的原药储备液，4 ℃保存备用；RPMI 1640购自郑州科诺生物技术有限公司；胰蛋白酶购自基诺生物医药术有限公技司；胎牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司；硫基罗丹明蛋白染料(SRB)购自美国Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒和Hoechst33342-PI双染检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2细胞培养SGC-7901细胞培养于含有体积分数10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和0.1 kg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3SRB法检测2-ME对SGC-7901细胞增殖的影响取处于对数生长期的SGC-7901细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，调整细胞浓度，5×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后弃去培养液，加入含不同浓度(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)2-ME的培养液，每孔反应体系0.2 mL，空白对照组以RPMI 1640培养液补足，每组设6个复孔，继续分别培养24、48、72 h后，倒置显微镜下进行形态学观察。用预冷的三氯乙酸(TCA)固定细胞10 min，移入4 ℃环境下静置1 h后，除去固定液，每孔用去离子水洗5遍，自然晾干。每小孔中加100 μL SRB染色，室温避光放置15 min,弃去染液，用体积分数1%冰醋酸将未结合的SRB染液洗去，每孔5遍，自然晾干。结合的SRB用Tris碱液150 μL溶解，用全自动酶标仪在515 nm处测定每孔光密度(OD)值，细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4SRB法检测2-ME和冬凌草甲素对SGC-7901细胞增殖的影响取处于对数生长期的SGC-7901细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，调整细胞浓度，5×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后弃去培养液，分别加入含以下浓度药物的培养基：0.625、1.250、2.500、5.000 μmol/L 2-ME和相同浓度的冬凌草甲素，以及2-ME与冬凌草甲素以上浓度的混合液，于培养箱中作用48、72 h后，按上述SRB法处理96孔板中细胞，再测定每孔OD值，按1.3中方法计算细胞增殖抑制率，最后计算每组IC50值，采用Chou-Talalay 法[6]，计算结合指数(combination index,CI)，CI<1.0时表示协同作用,CI=1.0时表示相加作用,而CI>1.0时则表示拮抗作用。

2　结果

2.1不同浓度2-ME作用不同时间后SGC-7901细胞增殖抑制率测定结果见图1。不同浓度2-ME作用SGC-7901细胞48和72 h，随着药物浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐增加。不同浓度2-ME作用SGC-7901细胞24 h时，随着药物浓度的增加，细胞增殖抑制率有先增加后降低的趋势。相同浓度2-ME作用于SGC-7901细胞的增殖抑制率表现出时间依赖性。

图1　不同浓度2-ME作用不同时间后对SGC-7901细胞增殖的抑制作用

2.2不同浓度2-ME作用48 h SGC-7901细胞形态变化结果见图2。存活细胞数目随2-ME浓度增大而减少,且药物作用后细胞形态与空白对照组相比发生明显变化，细胞变圆、皱缩，有凋亡小体生成。

A：0.500 μmol/L 2-ME；B：2.000 μmol/L 2-ME；C：4.000 μmol/L 2-ME；D：16.000 μmol/L 2-ME；E：对照。图2　不同浓度2-ME作用48 h SGC-7901细胞形态变化

2.32-ME和冬凌草甲素对SGC-7901细胞增殖的影响见图3。不同浓度的2-ME和冬凌草甲素作用SGC-7901细胞48 h后，均表现不同程度增殖抑制作用，两者联合用药也对细胞有明显增殖抑制作用，2-ME对SGC-7901的IC50值为5.31 μmol/L，冬凌草甲素对SGC-7901的IC50值为18.14 μmol/L，两者联合用药IC50值为8.46 μmol/L，CI为0.989，两者联合作用48 h后，对SGC-7901细胞增殖的抑制有相加作用。

A：2-ME；B：冬凌草甲素；C：2-ME和冬凌草甲素。图3　2-ME和冬凌草甲素单独与联合作用SGC-7901细胞48 h后的细胞增殖抑制率

2.4流式细胞仪检测2-ME和冬凌草甲素对SGC-7901细胞凋亡的影响0.625、2.500、10.000、20.000 μmol/L的2-ME诱导的凋亡细胞占细胞总数分别为(15.46±0.88)%、(23.42±1.44)%、(35.97±1.69)%、(38.74±2.69)%，呈明显浓度依赖性；2.500 μmol/L冬凌草甲素诱导细胞凋亡率为(12.68±1.34)%；2.500 μmol/L冬凌草甲素和2-ME混合液诱导细胞凋亡率为(13.15±1.25)%，介于单独应用2-ME和冬凌草甲素之间，未呈现协同作用。

2.52-ME和冬凌草甲素对SGC-7901细胞凋亡影响的Hoechst33342/PI双染检测结果荧光倒置显微镜结果(图4)显示细胞凋亡呈明显浓度依赖性，与流式细胞仪检测结果一致，而2.500 μmol/L冬凌草甲素和2-ME混合液诱导的凋亡明显少于2.500 μmol/L 2-ME且多于2.500 μmol/L冬凌草甲素引起的凋亡，与流式细胞仪结果一致。两药联合应用并未呈现协同作用。

A：2.500 μmol/L 2-ME；B： 2.500 μmol/L冬凌草甲素；C：2-ME和冬凌草甲素混合液；D：细胞对照。图4　Hoechst33342/PI 双染检测2-ME和冬凌草甲素对SGC-7901细胞凋亡的影响结果(×200)

3　讨论

胃癌是我国常见的恶性肿瘤，其病死率居各类恶性肿瘤之首，且多数患者为进展期胃癌[7]。联合化疗为其治疗的重要手段，但疗效差，同时化疗对机体有毒副作用，比如骨髓抑制、免疫抑制、胃肠道反应等。许多患者因为耐受不了而放弃治疗，更有一些身体状况不佳的患者因化疗而加速死亡，因此必须寻求新的药物配伍方案。

2-ME主要是抗血管新生，可将肿瘤细胞周期阻滞在G2/M期。作者用SRB法检测了不同浓度的2-ME对胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用，结果表明，2-ME在低浓度范围内对细胞的抑制作用随时间的延长而降低，而在浓度较大范围内则随时间的延长而增强；作用48、72 h具有浓度依赖性，而作用24 h在小于2 μmol/L范围内抑制率随浓度升高而增大，在大于2 μmol/L范围内抑制率随浓度升高而减小。这说明2-ME只是在一定浓度范围内对细胞的增殖抑制所用呈时间-浓度依赖性，具体原因可能和细胞的自噬有关[8]。自噬又称程序性死亡，是一个受严格调节的细胞内容物的降解和再循环的过程，参与了细胞器的代谢和再利用以及对细胞内的生物能量的补充。作为一种细胞生存的机制，自噬在很多生理过程如抵抗营养缺乏、 清除过剩或损坏的细胞器上发挥着重要的作用。自噬可能拮抗或延迟细胞凋亡 ,因为在一些情况下，自噬能通过清除损伤的线粒体而减弱凋亡的信号传导，另外，细胞凋亡和自噬可能作为彼此的后备机制从而执行不可逆的细胞死亡信号的传递[9]。

2-ME和冬凌草甲素都能够将肿瘤细胞阻滞在G2/M期，两者联用可能对细胞增殖抑制具有相加作用。作者的研究结果显示，2-ME和冬凌草甲素CI为0.989，接近于1，证实两者确实具有相加作用。流式细胞仪和荧光染色凋亡实验结果显示细胞凋亡率随2-ME药物浓度的升高而增加，呈现明显的浓度依赖性。而在2.500 μmol/L两者联合用药的细胞凋亡率高于2.500 μmol/L的冬凌草甲素而低于2.500 μmol/L的2-ME单独应用，此结果也与抑制增殖试验中联合用药组抑制率数值介于2-ME组和冬凌草甲素组之间一致。

总之，2-ME可以抑制SGC-7901细胞的增殖，诱导其凋亡，与冬凌草甲素联合应用对肿瘤细胞的抑制表现为相加作用，对凋亡未表现出协同作用。

[1]张学亚,战榕,潘敬新.2-甲氧基雌二醇诱导肿瘤细胞凋

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[2]梅娟娟,朱尤庆,常城,等.2-甲氧基雌二醇对肝癌huh7细胞增殖与凋亡的作用及机制[J].武汉大学学报(医学版),2012,33(1):23

[3]胡瑞华,王燕,李红英,等.冬凌草甲素抑制体内外卵巢癌生长的作用[J].天津医药,2012,40(3):269

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[5]季宇彬,洪宝,高世勇.冬凌草甲素抑制人胃癌SGC-7901细胞生长的G2/M期阻滞机制研究[J].中草药,2010,41(12):2024

[6]汪维佳，虞娉.白藜芦醇增强顺铂对肝癌细胞Bel-7402的生长抑制作用[J].实用肿瘤杂志,2009,24(2):157

[7]曹鸿艳,费洪新,纪慧,等.紫杉醇对人胃癌 SGC7901细胞株增殖机制影响的实验研究[J].中华中医药学刊,2009,27(12):2590

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(2015-12-26收稿责任编辑李沛寰)

Effect of 2-methoxy estradiol and oridonin on proliferation and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells in vitro

LIYinying1)，CHENChengqun2)，ZHANGZhenzhong3)

1)DepartmentofPharmacology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500142)DepartmentofPharmacology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500523)CollegeofPharmacology,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2-methoxy estradiol；proliferation；apoptosis;gastric cancer;SGC-7901 cell

Aim: To study the effect of 2-methoxy estradiol(2-ME) separate and combined with oridonin treatment on proliferation and apoptosis of gastric cancer strain SGC-7901 in vitro. Methods: SGC-7901 cells were treated with 0.125,0.250,0.500,1.000,2.000,4.000,8.000,16.000 μmol/L 2-ME for 24, 48 and 72 h, cells morphological changes were observed,and SRB assay was applied to detect the SGC-7901 cell growth; with different concentration (0.625,2.500,10.000,20.000 μmol/L)2-ME and the same concentration oridonin separately treatment on SGC-7901 cells for 48 h, the combination index was calculated,and the apoptosis of the cells by flow cytometry and fluorescent staining was observed. Results: TheIC50of 2-ME acted on SGC-7901 cells was 5.31 μmol/L, and the inhibitory effect of 2-ME on SGC-7901 cells was concentration- and time- dependent. After being treated by different concentrations of 2-ME for 48 h, the apoptosis rate of SGC-7901 cells was increased with the increase of the dose, and the effect of 2-ME on apoptosis had no synergistic. Conclusion: 2-ME can inhibit the proliferation of SGC-7901 cells, induce apoptosis, and enhance the effect of oridonin.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.012

，男，1964年11月生，博士，教授，研究方向：肿瘤靶向治疗，E-mail：zhangzz08@126.com

*国家自然科学基金资助项目81573364

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