王欣欣，马珊珊，孟　楠，邢　衢，黄团结，程　康，杨　波，关方霞1,#

1)郑州大学第一附属医院干细胞研究室 郑州 450052　2)郑州大学生命科学院干细胞研究室 郑州450001



hUC-MSCs和白藜芦醇对AD小鼠学习记忆能力及脑内SIRT1信号通路的影响*

王欣欣1)，马珊珊2)，孟楠1)，邢衢2)，黄团结2)，程康2)，杨波1)，关方霞1,2)#

1)郑州大学第一附属医院干细胞研究室 郑州 4500522)郑州大学生命科学院干细胞研究室 郑州450001

白藜芦醇；人脐带间充质干细胞；阿尔茨海默症；SIRT1；小鼠

目的：探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)移植联合白藜芦醇(RES)灌胃对AD小鼠学习记忆能力的影响及对脑内SIRT1信号通路的调控作用。方法：40只AD小鼠随机分为AD组、hUC-MSCs组、RES组、hUC-MSCs联合RES组(联合组)，每组10只。干预8周后，用Morris水迷宫评估小鼠学习记忆能力；取小鼠脑组织，采用免疫组化法检测Nestin的表达，TUNEL检测神经细胞凋亡，qRT-PCR检测神经营养因子BDNF、NGF和NT-3 mRNA的表达水平，Western blot法检测SIRT1、PCNA、P53、P21和P16的表达。结果：hUC-MSCs与RES均可使AD小鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，目的象限停留时间增加；海马区再生细胞增多，凋亡细胞减少，BDNF、NGF和NT-3 mRNA表达水平升高，SIRT1和PCNA蛋白的表达增强，P53、P21、P16蛋白的表达减弱(P<0.05)。 hUC-MSCs和RES联合对AD小鼠学习记忆能力、神经细胞再生、BDNF以及SIRT1蛋白的表达具有协同作用(P<0.05)。结论：hUC-MSCs移植和RES灌胃可能通过调控脑内SIRT1信号通路共同促进AD小鼠学习记忆能力的改善。

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种与年龄相关的中枢神经系统退行性变，临床主要表现为认知能力下降，病理学表现为脑内淀粉样沉积和纤维样缠绕[1],目前仍无有效的干预措施。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能分泌多种神经营养因子并具有神经分化的潜能，在神经损伤、神经退行性变动物模型中发挥神经保护作用[2]。作者所在的课题组前期研究[3]发现MSCs移植可改善AD鼠的学习记忆能力且无明显副作用，为治疗AD提供了新途径。白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种存在于葡萄等植物中的多酚类化合物，能通过激活SIRT1发挥抗衰老、保护神经和延长寿命的作用[4]，并能够促进脂肪间充质干细胞的生存，调控骨髓间充质干细胞的神经分化[5-6]。但是，RES是否能协同人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived MSCs,hUC-MSCs)移植治疗AD尚不明确。该研究采用hUC-MSCs移植联合RES灌胃干预AD小鼠，观察AD鼠行为学和组织学改善，并探讨SIRT1信号通路的介导作用。

1　材料与方法

1.1材料新生儿脐带来自郑州大学第一附属医院妇产科(产妇签署知情同意书)，经分离、原代细胞培养传代得到第4代(P4) hUC-MSCs用于移植。DMEM/F12培养基购自宝信生物科技有限公司，胎牛血清购自美国Gemini公司，RES购自美国Sigma公司，DNA小提试剂盒、Trizol、逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，抗体购自Santa Cruz公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物公司，SP二步法免疫组化二抗试剂盒、DAB染色试剂盒、苏木精购于武汉博士德生物工程有限公司。APP695V717I转基因小鼠购自中国协和医科大学动物所。

1.2APP转基因小鼠的鉴定、分组与处理APP695V717I转基因小鼠具有脑内APP过表达的特点，可模拟AD。剪取鼠尾约0.5 cm，提取DNA，进行PCR扩增，APP引物: 5’-CCCTGAACCTGAAA CATAAAAT-3’(上游引物)和5’-GCTACGAAAATC CAACCTACAA-3’ (下游引物)，琼脂糖凝胶电泳鉴定。将经鉴定确认为APP+的小鼠随机分为4组，每组10只，分别为:AD组(APP+小鼠), hUC-MSCs组 (尾静脉移植 P4 hUC-MSCs 5×106mL-1，0.2 mL/只), RES组[RES灌胃200 mg/(kg·d)], RES+MSC组(hUC-MSC移植联合RES灌胃)。8周后进行以下指标的检测。

1.3Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力水迷宫水池直径1.2 m，平台直径10 cm，位于水池第一象限，离液面1 cm。训练阶段，小鼠首先于平台上停留10 s以熟悉环境，然后从不同象限固定位置入水，若小鼠60 s内未找到平台，将其引至平台停留10 s再进行下一象限实验。连续训练5 d，3次/d，第6天开始进行空间探索实验，撤去平台，分别从4个象限固定位置入水，用摄像采集系统捕获小鼠游泳轨迹，统计穿越平台次数、逃避潜伏期和平台所在象限停留时间等参数。

1.4免疫组化检测小鼠脑组织Nestin蛋白的表达

1.5TUNEL检测小鼠神经细胞凋亡取3只小鼠，处死取脑组织。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水， 0.01 mol/L枸橼酸微波修复、冷却后，用含TdT酶和FITC 标记的dUTP的反应液37 ℃孵育60 min(阴性对照组反应液中不含TdT酶)，PBS清洗3次，DAPI染核10 min，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察拍照。用Image J软件进行阳性细胞计数。

1.6qRT-PCR检测小鼠脑内神经营养因子(BDNF、NGF、NT-3)mRNA的表达Trizol裂解法提取脑组织总RNA，测RNA浓度和纯度后，逆转录合成cDNA。反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 2 μL,cDNA 0.4 μL,上下游引物各0.8 μL，dH2O 6 μL。反应条件：90 ℃ 5 min,90 ℃ 30 s,60 ℃ 34 s,40个循环。采用7500 Fast PCR仪进行扩增，获得Ct值，采用2-ΔΔCt计算目的基因的表达水平。BDNF、NGF、NT-3及内参GAPDH基因引物序列及产物片段长度见表1。

表1　实时荧光定量PCR引物序列及产物片段长度

1.8统计学处理采用SPSS 19.0处理数据。应用析因设计的方差分析探讨MSC移植和RES灌胃对水迷宫实验结果、Nestin+和TUNEL+细胞数、脑组织神经营养因子mRNA和SIRT1信号通路相关蛋白表达的影响，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1hUC-MSCs移植和RES灌胃对AD小鼠水迷宫测试结果的影响结果见表2。

2.2hUC-MSCs移植和RES灌胃对AD小鼠海马组织Nestin+细胞数及神经细胞凋亡的影响结果见表3。

2.3hUC-MSCs移植和RES灌胃对AD小鼠脑组织神经营养因子mRNA表达的影响结果见表4。

表2　4组小鼠水迷宫测试结果

表3　4组小鼠海马组织中Nestin+、凋亡神经细胞计数

表4　4组小鼠脑组织神经营养因子mRNA表达水平的比较

2.4hUC-MSCs移植和RES灌胃对AD小鼠脑内SIRT1信号通路相关蛋白表达水平的影响结果见表5。

表5　4组小鼠脑组织中SIRT1信号通路相关蛋白表达水平比较

3　讨论

该研究结果显示，hUC-MSCs移植或RES灌胃能改善AD小鼠学习记忆能力，促进AD小鼠脑组织神经营养因子BDNF、NGF、NT-3 mRNA的表达,并能促进内源性神经再生(Nestin+细胞增多)，减少细胞凋亡(TUNEL+细胞减少)。此外，有研究[7]提出，移植的干细胞可整合到神经系统替代受损细胞，因此该实验中移植的hUC-MSCs在AD小鼠脑内的存活与分化状况尚需进一步研究。

分子水平上，hUC-MSCs移植与RES灌胃均能上调小鼠脑组织SIRT1信号通路相关因子如SIRT1、PCNA蛋白的表达，下调P53、P21和P16蛋白的表达。 PCNA表达增高在一定程度上反映了神经再生增强，因为PCNA是一种S期细胞增殖的标志物[8]。P53表达增高与神经元凋亡和退化相关[9]，AD鼠治疗后P53蛋白表达下降，提示神经凋亡减少。p53-p21是调控衰老的重要信号[10]，p16也是与衰老密切相关的基因[11]，而且其表达受SIRT1基因影响[12]。该研究中RES灌胃和hUC-MSCs移植治疗后AD小鼠脑组织SIRT1增加伴随着P53、P21和P16蛋白表达减少，提示抗衰老作用增强。因此，SIRT1及相关因子PCNA、 P53、 P21和P16的改变可能是hUC-MSCs和RES治疗AD的分子机制。

另外，hUC-MSCs移植和RES灌胃联合对AD鼠学习记忆能力、神经细胞再生、BDNF以及SIRT1蛋白的表达具有协同作用。

综上所述，RES和hUC-MSCs作用于AD小鼠可协同促进神经再生，抑制神经凋亡，提高学习记忆能力。RES灌胃联合hUC-MSCs移植有望成为一种更有效的AD治疗手段。

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(2015-10-29收稿责任编辑徐春燕)

Effects of hUC-MSCs and resveratrol on learning and memory capability and SIRT signaling pathway in brain tissue of AD mice

WANGXinxin1)，MAShanshan2),MENGNan1)，XINGQu2),HUANGTuanjie2),CHENGKang2),YANGBo1)，GUANFangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

resveratrol;human umbilical cord derived mesenchymal stem cell; Alzheimer′s disease;SIRT1;mouse

Aim: To investigate the effects of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) transplantation and resveratrol(RES) gavage on the cognition of AD mice and SIRT1 signaling pathway in brain tissue. Methods: Forty AD mice were randomly allocated into AD group, hUC-MSCs group, RES group and hUC-MSCs combined with RES group(combined group). Eight weeks after intervention, Morris water maze was employed to evaluate the learning and memory capability; the brain tissue was prepared, immunohistochemistry was used to detect the expression of Nestin, TUNEL was used to detect cell apoptosis, qRT-PCR was used to examine the expressions of neurotropic factors BDNF, NGF and NT-3 mRNA,and Western blot was used to examine the expressions of SIRT1, PCNA, P53, P21 and P16 protein.Results: hUC-MSCs and RES could improve learning and memory capability, as evidenced by shorter latency, more crosses and time spent in the target quadrant in the Morris water maze; hUC-MSCs and RES could both enhance hippocampus neurogenesis,alleviate apoptosis,upregulate the expressions of BDNF, NGF and NT-3 mRNA as well as enhance the expressions of SIRT1 and PCNA and inhibit the expressions of P53, P21 and P16. Furthermore, hUC-MSCs and RES exerted synergistic effects on the learning and memory capability,regeneration of neuronal cells as well as upregulated the expressions of BDNF and SIRT1. Conclusion: hUC-MSCs transplantation and RES gavage could synergistically improve learning and memory capability of AD mice via regulating SIRT1 signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.005

*国家自然科学基金资助项目81471306，U1404313；河南省高校科技创新团队支持计划15IRTSTHN022；河南省科技创新人才计划 154200510008;河南省高等学校重点科研项目计划17A310012；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题20114101110004

，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干细胞与再生医学， E-mail:guanfangxia@126.com

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