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四物汤配方颗粒的质量标准研究

2016-09-20官永河杜兰哲霍文杰钟华林赵径华陈向东广东一方制药有限公司佛山528244

北方药学 2016年2期
关键词:四物汤芍药甲醇

官永河 杜兰哲 霍文杰 钟华林 赵径华 陈向东(广东一方制药有限公司 佛山 528244)

·药品质量及检验·

四物汤配方颗粒的质量标准研究

官永河杜兰哲霍文杰钟华林赵径华陈向东(广东一方制药有限公司佛山528244)

目的:建立四物汤配方颗粒的质量控制方法。方法:采用薄层色谱(TLC)法鉴别四物汤配方颗粒中的熟地黄、当归、川芎、白芍,采用高效液相色谱(HPLC)法测定四物汤配方颗粒中的芍药苷、阿魏酸的含量。结果:TLC法分离较好,阴性无干扰;HPLC法芍药苷线性范围为0.1031~1.6496μg,r=1.000;阿魏酸线性范围为0.0209~0.3344μg,r=0.9997。平均回收率分别为100.46%、101.55%,RSD均小于2.0%。结论:该方法专属性强,重复性好,可用于控制四物汤配方颗粒的质量。

四物汤配方颗粒 芍药苷 阿魏酸 薄层色谱 高效液相色谱

四物汤由白芍、当归、熟地黄、川芎四味药组成。该方最早见于唐代蔺道人的《仙授理伤续断秘方》,为治疗营血虚滞的著名方剂,具有补血和血功效。四物汤临床上用于血虚所致的面色萎黄、头晕眼花、心悸气短及月经不调的治疗,效果显著。药效学研究和临床研究显示,该方具有抗缺氧、免疫调节、抗自由基损伤、血液系统作用及双向调节子宫平滑肌的作用,原方或其加减方现代临床常用于治疗胎位不正、月经失调、功能性子宫出血、子宫肌瘤等妇科疾病,还可用于内科、皮肤科疾病的治疗,取得了较好的治疗效果。2015年版《中国药典》一部[1]收载了四物合剂的制剂标准,其中阿魏酸是川芎和当归共同含有的活性成分,具有抗血小板凝集和血栓的作用[2],芍药苷为白芍主要活性成分,用于对抗急性心肌缺血,降低血压,扩张冠状动脉,增加冠脉流量[3]。

四物汤配方颗粒是由白芍、当归、熟地黄、川芎四味药按古方比例用水煎煮后制粒而成,在传承中药配方颗粒的优点的情况下,按照中医药整体观念,将其制成复方颗粒剂,充分发挥群药共煎及配伍的优势,同时克服汤剂临时煎煮不便、服用量大、易霉败变质等缺点。本研究在参考文献[4]的基础上,对四物汤配方颗粒中的熟地黄、白芍、当归和川芎进行定性鉴别,采用高效液相色谱法测定芍药苷、阿魏酸的含量。

1 仪器与试药

1.1仪器:Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2489紫外检测器、Empower 2 Personal Single System SW化学工作站;Kromasil 100-5 C18柱(4.6mm×150mm,5μm);薄层色谱自动点样仪(CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER4)、薄层自动成像仪(CAMAG REPROSTAR 3);BS110S万分之一天平(赛多利斯)、xP26百万分之一天平(METTLER TOLEDO);CQ-25-6超声波清洗器(上海音波声电科技公司)。

1.2试药:芍药苷(供含量测定用,批号:110736-201035);阿魏酸(供含量测定用,批号:110773-201012);白芍对照药材(供薄层鉴别用,批号:905-9204),均购自中国药品生物制品检定所;5-羟甲基糠醛(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供,供含量测定用,批号:1001200655);四物汤配方颗粒(自制,批号:20141101、20141102、20141103);阴性对照样品按处方药味除去被测药材,其余药味,按四物汤配方颗粒的生产工艺及供试品溶液的制备方法制备,即得。实验用四批药材均购自安徽省本草国药饮片有限公司,经魏梅副主任中药师鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1薄层鉴别

2.1.1当归、川芎的薄层鉴别:取本品0.8g,研细,加水40mL使溶解,用乙醚萃取2次,每次30mL,合并乙醚,挥干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,作为对照品溶液。按处方比例及制法,制成缺当归、川芎的阴性对照样品,取相当于供试品的量,按照供试品溶液的制备方法,制成缺当归、川芎的阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述三种溶液各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.3)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照样品无干扰,结果见图1。

2.1.2白芍的薄层鉴别:取本品1g,研细,加水30mL使溶解,用水饱和正丁醇溶液萃取2次,每次25mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取白芍对照药材1g,加水60mL,煎煮30min,滤过,滤液用水饱和正丁醇溶液萃取2次,同法制成对照药材溶液。按处方比例及制法,制成缺白芍的阴性对照样品,取相当于供试品的量,按照供试品溶液的制备方法,制成缺白芍的阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述供试品溶液5μL,对照药材溶液2μL分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛浓硫酸溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置日光下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照样品无干扰,结果见图2。

2.1.3熟地黄的薄层鉴别:取本品2g,研细,加水50mL使溶解,用乙酸乙酯萃取2次,每次50mL,合并乙酸乙酯,蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取5-羟甲基糠醛对照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液。按处方比例及制法,制成缺熟地黄的阴性对照样品,取相当于供试品的量,按照供试品溶液的制备方法,制成缺熟地黄的阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述供试品10μL,对照品1μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯(2∶3)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。阴性对照样品无干扰,结果见图3。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件:色谱柱:KromasiL 100-5 C18柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%醋酸(10∶90);流速:1mL·min-1;检测波长:240nm;柱温30℃。进样量:10μL;塔板数按芍药苷峰计算应不低于4000。

2.2.2溶液的制备

2.2.2.1对照品溶液的制备:精密称取芍药苷对照品2.58mg,置25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1mL含芍药苷0.1032mg);精密称取阿魏酸对照品1.048mg(99.6%),置50mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1mL含阿魏酸0.0209mg)。

2.2.2.2供试品溶液的制备:取本品,研细,取约0.4g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,密塞,称定重量,超声处理(功率250W,频率33kHz)30min,放冷,称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.2.3阴性样品溶液的制备:采用上述四物汤配方颗粒的制备方法分别制备缺白芍阴性样品、缺熟地黄阴性样品和缺当归、川芎阴性样品,按供试品溶液的制备方法,分别制备阴性样品溶液。2.2.3专属性考察:分别吸取芍药苷对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、四物汤配方颗粒供试品溶液、阴性样品溶液,按上述四物汤配方颗粒的含量测定方法,四物汤配方颗粒中芍药苷、阿魏酸峰应与相邻的峰分离度大于1.5,阴性样品色谱在芍药苷、阿魏酸峰相应位置上无干扰。结果见图4。 2.2.4线性关系考察:分别精密吸取芍药苷、阿魏酸对照品溶液0.5、1、2、4、8、12、16μL,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,绘制标准曲线。结果表明,芍药苷进样量在0.1031~1.6496μg时与峰面积呈良好的线性关系。回归方程为Y=1052006x-4783,r=1.000。阿魏酸进样量在0.0209~0.3344μg时与峰面积呈良好的线性关系。回归方程为Y= 3337200x+1928,r=0.9997。

2.2.5精密度考察:取一份四物汤配方颗粒供试品溶液,按上述色谱条件,重复进样6次,测定芍药苷、阿魏酸峰面积。结果,芍药苷峰面积的RSD为1.76%,阿魏酸峰面积的RSD为1.11%,表明仪器的精密度良好。

2.2.6稳定性考察:取同一四物汤配方颗粒供试品溶液,按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、12h进样,测定芍药苷、阿魏酸峰面积。结果,在12h内测得四物汤配方颗粒中芍药苷的峰面积RSD为1.10%、阿魏酸的峰面积RSD为1.36%。实验结果表明,供试品溶液在12h内稳定。

2.2.7重复性考察:取同一四物汤配方颗粒,按上述方法平行制备供试品溶液六份,分别测定芍药苷、阿魏酸含量。结果,芍药苷平均含量为6.198mg·g-1,RSD为0.37%;阿魏酸平均含量为0.606mg·g-1,RSD为1.29%,此样品中含量测定方法重复性较好。

2.2.8回收率考察:取已知含量的四物汤配方颗粒粉末约0.2mg(芍药苷含量:6.198mg·g-1、阿魏酸含量:0.606mg·g-1),精密称定,共六份,置具塞锥形瓶中,精密加入含芍药苷、阿魏酸混合对照品(甲醇溶解,芍药苷浓度为0.05352g·L-1,阿魏酸浓度为0.005724g·L-1)25mL,按“2.3.2.2”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进行测定,计算回收率。结果见表1、表2。

表1 四物汤配方颗粒芍药苷含量测定回收率试验结果

表2 四物汤配方颗粒阿魏酸含量测定回收率试验结果

2.2.9样品含量测定:分别制备3批四物汤颗粒剂供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进行测定,采用外标法计算四物汤配方颗粒中2种成分含量,实验结果见表3。

表3 3批四物汤配方颗粒含量测定结果

3 讨论

本次熟地黄的薄层鉴别实验过程中,曾经尝试使用熟地黄对照药材,但发现对照药材色谱与供试品色谱斑点有差异,故只采用5-羟甲基糠醛对照品作对照。曾经尝试采用石油醚(60-90)-乙酸乙酯(1∶1)的方法展开,但展开效果不理想,最后选择甲苯-乙酸乙酯(1∶1)的方法,经过试验调整比例为甲苯-乙酸乙酯(2∶3),效果较好。

当归、川芎的薄层鉴别实验过程中,曾经尝试使用当归、川芎对照药材,但发现对照药材色谱比四物汤供试品色谱多了挥发油的斑点,故只采用阿魏酸对照品对照。曾经尝试采用正己烷-乙酸乙酯(9∶1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶0.1)的方法展开,但展开效果不理想,最后选择环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)的方法,经过试验调整比例为环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.3),效果较好。

白芍的薄层鉴别实验过程中,参考药典方法,曾采用乙醇提取,但斑点很多分不开,效果不好。使用正丁醇提取,并采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂,效果较好。

本次含量测定方法的建立,在流动相的选择上,文献中已有多种报道,曾经尝试以甲醇-0.1%醋酸(14∶86)、甲醇-0.1%磷酸(14∶86)、乙腈-0.1%磷酸(20∶80)等方法用于本样品分离,但效果均不够理想,本试验采用流动相乙腈-0.1%醋酸(10∶90)的比例,能使芍药苷、阿魏酸的色谱峰形对称、结果保留时间适中、分离效果较好,可以满足含量测定的基本要求。

本次研究曾经对四物汤配方颗粒供试品制备的提取方法(超声提取、加热回流提取)、提取溶剂(甲醇、75%甲醇、50%甲醇)、提取时间(20、30、40min)进行优选,实验结果表明,采用超声提取时,芍药苷、阿魏酸的含量都比加热回流提取高,故选择超声提取。采用甲醇提取时,芍药苷、阿魏酸的含量都比75%甲醇、50%甲醇高,故选择甲醇提取。提取时间为20、30、40min时,芍药苷、阿魏酸含量相差不大,考虑到节能降耗及操作方便问题,故选择超声时间30min。本次研究建立的方法简便可行、重复性好、阴性无干扰,为四物汤配方颗粒的质量控制提供了依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:786-787.

[2]夏醒醒,张蓓蕾,陈勤.RP-HPLC法测定四物合剂中阿魏酸的含量[J].中国药事,2007,21(4):247-249.

[3]孟令丹,陈晓辉,姚燕,等.RP-HPLC法同时测定四物合剂中芍药苷和阿魏酸的含量[J].药物分析杂志,2006,26(10):1398-1400.

[4]周海燕.四物汤配方颗粒质量标准示范性研究[D].成都中医药大学,2006.

Objective:To establish a quality standard for Siwutang Peifangkeli.Methods:Radix Paeoniae Alba,Radix Angelicae Sinensis,Rhizoma Chuanxiong and Radix Rehmanniae were indentified by TLC.The contents of Paeoniflorin and Ferulic acid were determined by HPLC.Results:The specific spots of Radix Paeoniae Alba,Radix Angelicae Sinensis,Rhizoma Chuanxiong and Radix Rehmanniae could be detected by TLC.The linear calibration curves were established in the concentration range of 0.1031~1.6496μg(r=1.000)for Paeoniflorin and 0.0209~0.3344μg(r=0.9997)for Ferulic acid.The average recoveries of Paeoniflorin and Ferulic acid were 100.46% and 101.55%,respectively.All the relative standard deviations were Less than2.0%.Conclusion:The method is simple,feasible and reproducible.It can be used for quality control of Siwutang Peifangkeli.

Siwutang Dispensing Granule Paeoniflorin;Ferulic acidTLC HPLC

R284.1

A

1672-8351(2016)02-0001-03

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