元建国，叶海艳，李世林△，陈利民▲

(1.成都大学门诊部，成都 610000;2.中国医学科学院/北京协和医学院输血研究所，成都 610063)



甲氨蝶呤对固有免疫关键分子干扰素的影响研究

元建国1，叶海艳2，李世林2△，陈利民2▲

(1.成都大学门诊部，成都 610000;2.中国医学科学院/北京协和医学院输血研究所，成都 610063)

目的为了探究具有免疫抑制和抗肿瘤作用的甲氨蝶呤(MTX)对干扰素(IFN)的影响，以及IFN在风湿免疫性疾病中的作用。方法以5、20、100 μg/mL浓度梯度的MTX作用于Huh7.5.1细胞48 h，采用实时荧光定量PCR法定量检测MTX干预后Huh7.5.1细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、干扰素刺激基因15(ISG15)、抗黏病毒蛋白(MxA)的mRNA 表达量。结果Huh7.5.1细胞在MTX(5、20 μg/mL)干预下内源性IFN-α、IFN-β的mRNA表达量与对照组相比均明显上升,差异均有统计学意义(P<0.05),并且随着MTX干预浓度的上升而上升；MTX 浓度为 100 μg/mL 时，与对照组相比虽有上升但差异无统计学意义(P>0.05)。而IFN-γ的mRNA表达量仅在MTX浓度为20 μg/mL时与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，在5、100 μg/mL 时虽有上升但差异无统计学意义(P>0.05)。在MTX干预后，MxA和ISG15的mRNA表达量均有不同程度的上升(P<0.05)。结论小剂量MTX治疗风湿免疫性疾病取得良好的疗效与IFN相关。

甲氨蝶呤；固有免疫；干扰素

固有免疫是机体与生俱来的抵御病原微生物入侵的第一道防线，具有抵抗体外病原体侵袭、清除体内抗原性异物的能力，是生物体在漫长的进化和自然选择过程中形成的防御机制[1]。固有免疫具有抗感染、抗肿瘤、维持自身耐受，以及启动和参与特异性免疫等作用[2]。干扰素(IFN)是固有免疫系统重要的固有免疫分子，是最早发现的细胞因子，因其具有干扰病毒的感染和复制功能而得名。根据其来源和理化性质，可分为Ⅰ型(IFN-α、IFN-β)、Ⅱ型(IFN-γ)及Ⅲ型。

IFN-α、IFN-β由许多不同的细胞(所有有核细胞，特别是成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞)在应答病毒或胞内细菌感染时产生。IFN-α、IFN-β 的受体相同，几乎表达于所有有核细胞表面，功能广泛，包括抗病毒、免疫调节，以及促进组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子和Ⅱ类分子的表达。IFN-γ主要由活化的T细胞、自然杀伤细胞诱导产生，具有抗病毒，活化巨噬细胞，促进MHC分子表达的抗原提呈，诱导Th1分化，抑制Th2分化的作用[3-4]。

甲氨蝶呤(MTX)用于风湿免疫性疾病已数十年，被全世界的风湿免疫学者普遍接受，在治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、血管炎、干燥综合征等疾病中都取得了良好的效果[5]。MTX是二氢叶酸还原酶抑制剂，是一种叶酸拮抗剂，与二氢叶酸还原酶底物叶酸结构相似，能有效地占据酶催化中心，它与该酶的结合力比叶酸大106倍，对二氢叶酸还原酶呈强大而持久的竞争性抑制作用，使二氢叶酸不能变成四氢叶酸，导致DNA合成障碍，阻止嘌呤核苷酸的合成，而干扰蛋白质的合成[6-8]。

IFN是固有免疫分子中的一种细胞因子，是固有免疫系统重要的组成成分，在整个免疫系统中具有重要意义，但在风湿免疫性疾病中，IFN在疾病的发生、发展及转归、预后中的作用和地位尚不十分清楚，同时，临床常用的免疫抑制剂对IFN的影响亦不明了。因此，为了探究MTX对IFN的影响，以及IFN在风湿免疫性疾病中的作用，本研究以不同浓度的MTX作用于Huh7.5.1细胞，采用实时荧光定量PCR法定量检测MTX干预后Huh7.5.1细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、干扰素刺激基因15(ISG15)、抗黏病毒蛋白(MxA)的mRNA 表达量，探讨并试图从基因水平证明MTX对IFN的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞Huh7.5.1细胞:人肝癌细胞系，本实验室长期保存。

1.1.2主要试剂及仪器MTX片；胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)购自Hycone公司；达氏修正依氏培养基(DMEM，高糖)购自Hyclone公司；非必需氨基酸(Non-essentialamino acids，NEAA)购自Gibico公司；双抗(青霉素-链霉素)购自Hyclone公司；0.25%的胰酶购自Gibico公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自Gibico公司；IFN-α购自Merck&Co公司；Trizol购自Ambion公司；逆转录试剂盒购自Bio-rad公司；SYBR荧光染料试剂盒购自Roche公司。

倒置荧光显微镜(CKX31型)购自Olympus公司；Fast Real-Time PCR system(7500HT)购自Applied Biosystem公司；PCR仪(Veriti 96 Well)购自Applied Biosystem公司；二氧化碳培养箱购自Thermo electric公司；生物洁净工作台购自Airtech公司；96孔板离心机(3K15)购自Sigma公司；高速台式冷冻离心机购自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1MTX片溶解液的配置配置0.71%的无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)溶液和0.69%磷酸二氢钠(NaH2PO4)溶液，取500 mL Na2HPO4溶液和600 mL NaH2PO4溶液混合摇匀，用2 mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值为6.9。

1.2.2细胞培养、分组及RNA的提取(1)细胞培养:①用0.25%的胰酶将培养瓶中的细胞消化下来后转移至50 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用完全培养基重悬细胞；②取10 μL细胞悬液至10 μL 0.4%台盼蓝中充分混匀后加入计数板中计数；③根据细胞密度加入完全培养基，调整细胞浓度为2×105/mL；④在24孔细胞培养板中每孔加入500 μL Huh7.5.1细胞悬液；⑤37 ℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。(2)分组：细胞贴壁后进行药物处理，将MTX加入细胞培养板中，使终浓度分别为5、20、100 μg/mL，每个浓度设3个重复孔，放入37 ℃ 5%CO2培养箱中继续培养48 h；对照组细胞正常培养，未做任何处理。(3)RNA提取:将Trizol加入24孔细胞培养板中，每孔加入200 μL，反复吹打细胞后转移至1.5 mL离心管中，室温放置5 min。加入40 μL氯仿，剧烈振荡10 s后室温放置5 min。4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。吸取100 μL水相转移入新的 1.5 mL离心管中，加入100 μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，移去上清。加入 200 μL 75%乙醇，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，弃上清以洗涤沉淀。室温放置使乙醇挥发后，加入 30 μL无RNA酶(RNase)的焦碳酸二乙酯(DEPC)水，用枪头吸打几次使其充分溶解，-80 ℃保存备用。

1.2.3引物的序列和合成[9-11]IFN-α：上游引物5′-TCG CCC TTT GCT TTA CTG AT-3′，下游引物5′-GGG TCT CAG GGA GAT CAC AG-3′；IFN-β：上游引物5′-AAA CTC ATA GCA GTC TGC A-3′，下游引物5′-AGG AGA TCT TCA GTT TCG GAG G-3′；IFN-γ：上游引物5′-CCA ACG CAA AGC AAT ACA TGA-3′，下游引物5′-TTT TCG CTT CCC TGT TTT AGC-3′；MxA：上游引物5′-GTG CAT TGC AGA AGG TCA GA-3′，下游引物5′-CTG GTG ATA GGC CAT CAG GT-3′；ISG15：上游引物5′-CGC AGA TCA CCC AGA AGA TT-3′，下游引物5′-GCC CTT GTT ATT CCT CAC CA-3′；3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：上游引物5′-GCC TCC TGC ACC ACC AAC TG-3′，下游引物5′-ACG CCT GCT TCA CCA CCT TC-3′。

1.2.4逆转录反应使用逆转录试剂盒，反应体系如下:5×Mix 1 μL，RNA模板3 μL，ddH2O 6 μL，总体积10 μL。反应条件:30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.2.5实时荧光定量PCR采用Roche公司的SYBR荧光染料试剂盒，反应体积为20 μL,反应体系:2×SYBR mix 10 μL，Primer-R 1μL，Primer-F 1μL，Template 1μL，ddH2O 7 μL。反应条件:95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环。采用2-△△CT法，以看家基因GAPDH作内参，得出待测目的基因mRNA相对表达量。

1.3统计学处理实验均设3次独立的重复实验，数据采用ANOVA软件进行统计分析，数据用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1各组细胞内IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA的表达比较Huh7.5.1细胞在MTX(5、20 μg/mL)干预下内源性IFN-α、IFN-β的mRNA表达量与对照组相比均上升,差异均有统计学意义(P<0.05)，并且随着MTX干预浓度的上升而上升；MTX 浓度为 100 μg/mL 时，与对照组相比虽有上升但差异无统计学意义(P>0.05)。而IFN-γ的mRNA表达量仅在MTX浓度为20 μg/mL时与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，在5、100 μg/mL 时虽有上升但差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

*：P<0.05，与对照组比较。

图1不同浓度的MTX对Huh7.5.1细胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA表达量的影响

2.2各组ISG15、MxA mRNA的表达比较在MTX干预后，MxA和ISG15的mRNA表达量均有不同程度的上升，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

*：P<0.05，与对照组比较。

图2MTX对ISG15、MxA mRNA表达量的影响

3　讨　　论

在临床实践中，大剂量MTX被用于抗肿瘤治疗，主要是抑制细胞增殖和复制，即抗增殖作用，是通过抑制二氢叶酸还原酶而阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，可阻止DNA合成，也可干扰RNA蛋白质的生物合成，从而达到阻止肿瘤细胞生成的作用[12]。而治疗风湿免疫性疾病是小剂量应用，其作用机制不能完全用抗增殖进行解释，每周1次小剂量治疗风湿病的机制可能是几种作用的结合，包括抗叶酸、免疫调节、免疫抑制及抗炎作用[13]。

IFN属于细胞因子中的一类，主要有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。本研究只涉及了Ⅰ型和Ⅱ型。IFN-α、IFN-β可由体内多种细胞产生，IFN-γ由自然杀伤细胞诱导产生，具有抗病毒和免疫调节的功能[14]。在正常生理情况下，多数细胞可以自发分泌少量内源性Ⅰ型IFN。IFN与干扰素受体(IFNR)结合激活Janus酪氨酸蛋白激酶/信号转导子与转录激活子(janus kinase signal transducersand activators of transcription，JAK/STAT)信号通路，该通路在调节细胞增殖、分化、凋亡，以及在免疫调节、炎症和肿瘤等多种病理生理过程中能发挥重要的作用[15]。

本实验表明，MTX能明显促进内源性IFN的分泌，并且能与IFNR结合激活IFN信号通路从而促进ISGs的表达，提示小剂量MTX治疗风湿免疫性疾病取得的良好疗效与IFN相关。本实验结果可以为进一步研究MTX治疗疾病的机制，以及对MTX的开发利用提供理论依据。

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The effects of methotrexate on innate immune molecule interferon

Yuan Jianguo1，Ye Haiyan2，Li Shilin2△，Chen Limin2▲

(1.Department of Outpatient,Chengdu University,Chengdu,Sichuan 610000,China；2.Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College,Chengdu,Sichuan 610063,China)

ObjectiveTo explore the effect of methotrexate(MTX),which has immunosuppressive and antitumor properties on interferon production and the role of interferon(IFN) in rheumatic autoimmune disease.MethodsCutured Huh7.5.1 cells were treated with different concentration of MTX(5,20,100 μg/mL) for 48 hours.After MTX intervention,the mRNA expression levels of IFN-α,IFN-β,IFN-γ,ISG15,MxA in Huh7.5.1 cells were quantified by real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsCompared with the control group,the endogenous IFN-α,IFN-β mRNA expressions of Huh7.5.1 cells under the intervention of methotrexate(5, 20 μg/mL) were significantly increased,the differences were statistically significant(P<0.05),which was increaing with the rise of the concentration of MTX intervention.MTX concentration of 100 μg/mL, compared with the control group,although there was an increase,but without statistical significance(P>0.05).While the mRNA expression of IFN-α was only significantly different when the MTX concentration was 20 μg/mL(P<0.05).Although there was an increase in 5 μg/mL and 100 μg/mL, there was no statistical significance(P>0.05).In MTX, the expression levels of MxA and ISG15 were increased in different degrees(P<0.05).ConclusionThe good efficacy of low-dose MTX in the treatment of rheumatic autoimmune diseases may be related to IFN.

methotrexate;innate immune;interferon

元建国(1955-)，主治医师，硕士，主要从事风湿免疫研究。△

，E-mail:shilin-li@hotmail.com。▲通讯作者，E-mail:limin_chen_99@yahoo.com。

·论著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.001

R392.1

A

1671-8348(2016)22-3025-03

2016-02-12

2016-03-25)