马梅兰　曾家豫　马瑾　袁红霞　牛童　廖世奇

两种方法去除肺癌患者血清高丰度蛋白的研究

马梅兰曾家豫马瑾袁红霞牛童廖世奇

目的：去除肺癌血清中的高丰度蛋白，为寻找肺癌早期肿瘤标志物奠定基础。方法：血清经除脂后按血清：水：乙腈= 1:2:4.5（v/v/v）沉淀分离高丰度蛋白，用SDS-PAGE验证去除效果。试剂盒去除血清高丰度蛋白，对体检健康者和非小细胞肺癌患者去除高丰度蛋白前后的血清凝胶电泳图像进行分析。结果：经本法去除后血清蛋白含量呈显著降低。与等量上样原血清电泳结果相比，相对分子量在50-80kD间的蛋白质被明显去除，而被其掩盖的相对分子质量在10kD以下的低丰度蛋白质得以显现。结论：乙腈沉淀法提供了一种经济、简便、重复性较好的人血清高丰度蛋白去除方法，为进一步寻找肺癌早期肿瘤标志物奠定了基础并提供了技术支持。

肺癌；高丰度蛋白；低丰度蛋白

近年来，肺癌的发病率和死亡率位于癌症之首［1］。用于肺癌早期诊断的肿瘤标志物其特异性和敏感性较低。目前，临床上常采用电化学发光法联合检测多项肺癌血清肿瘤标志物，操作复杂、成本昂贵。因此，探索未知的肿瘤特异性标志物成为研究的热点问题之一。血清蛋白质组学是蛋白质研究的一个重要分支［2］，因此，血清蛋白质组学的研究在探索未知的肿瘤特异性标志物方面发挥了重要作用。

血清蛋白质组成复杂，其之间浓度最大能相差十个数量级，潜在的与疾病相关的重要标志物在血浆和血清中的含量大多都相当低，浓度比含量最高的清蛋白浓度低5-10个数量级，其信息几乎完全被更高含量的高丰度蛋白和中等丰度蛋白信息所掩盖，利用现有的蛋白质组学技术检测血清中蛋白质的浓度变化会因为血清蛋白质组成的复杂性受到限制。因此，在对这些低丰度标记蛋白质进行研究之前必须尽可能地去除血清中高丰度蛋白的干扰。血清中含有大量的高丰度蛋白质（high-abundant proteins，HAP），包括白蛋白、免疫球蛋白等，而能够反映疾病病理、生理等相关信息的低丰度蛋白（low-aboundant proteins，LAP，分子量＜10kD的蛋白）被HAP所掩盖，因此去除血清中的HAP是血清蛋白质组学的首要任务。

本文采用依据亲和层析法原理制备的柱式白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒，并联合超滤离心法去除HAP和有机溶剂乙腈沉淀法去除高丰度蛋白，为后期肺癌血清肿瘤标志物的筛选奠定基础。

1　实验材料和方法

1.1实验材料 血清：2014年于甘肃省肿瘤医院采集的经病理组织学确诊为肺癌的患者血清。6名患者；男性3名，女性3名；平均年龄（51.7±2.1）岁；入院之前未经任何治疗，不伴随其他疾病，本实验所用血是经过伦理委员会批准的，患者知情同意，医院职工组织体检的正常血清为对照，年龄（48.3±3.2）岁，男3名，女3名。

1.2主要试剂乙腈（Acetonitrile，ACN）（Sigma）；丙烯酰胺（Acrylamide）（Solarbio）；N，N-甲叉双丙烯酰胺（Solarbio）；过硫酸铵（APS）（西安化学试剂厂）；无水乙醇（AR）（烟台市双双化工有限公司）；甘油（glycerol）（Sigma）；考马斯亮蓝R250（上海生工生物工程有限责任公司）；溴酚蓝（Bromophenol Blue）；TEMED （BBI）。

1.3使用仪器TGL-16高速台式冷冻离心机（长沙平凡仪器有限公司）；BCD-196TX低温冰箱（海尔集团）；MDF-390 AT超低温冰箱（日本三洋公司）；移液器（Eppendorf公司）；快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）；小型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；电热恒温水温箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.4血清预处理采用无抗凝剂采血管，对选定好的肺癌患者及健康者进行清晨空腹采血，每人抽取5ml。室温静置5min，然后置于低速自动平衡离心机离心（3500r/min，15min），去除血细胞并分离上层血清，然后将分离出来的血清再次置于高速冷冻离心机离心（4℃，12 000×g，15min），进一步去除血细胞，并在冰浴条件下分装血清，1.5mlEP管，每管1ml，并置于-80℃冻存。

1.5柱式白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒去除血清

HAP取出保存在-80℃冰箱的血清，置于4℃环境冻融，然后置于高速冷冻离心机离心（20℃，15 000×g，15min），去除上层脂层，收集血清，后续实验备用。

本文采取柱式白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒去除血清中的HAP。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。每次处理10µl血清，每批实验重复5次，处理量为肺癌患者血清50µl，正常血清50µl。然后，将去除HAP的血清收集起来，再一次通过Amicon Ultra-0.53kD的超滤离心管，进行二次大蛋白的截留。吸取下层液体并置于真空干燥仪，浓缩干燥。处理完毕的样品密封保存于4℃。

1.6乙腈沉淀法去除HAP参照朱慧等［3］去除HAP的实验，利用乙腈沉淀法去除血清中的HAP。

取出保存在-80℃冰箱的血清，置于4℃环境冻融，然后置于高速冷冻离心机离心（20℃，15 000×g，15min），去除上层脂层，收集血清，后续实验备用。

吸取100µl处理好的血清，置于1.5ml的EP管中，按照1∶2的比例，加入200µl超纯水，快速混匀30s，然后按照血清样品∶超纯水∶乙腈=1∶2∶4.5的比例，加入450µl乙腈，置于超声清洗器，水浴超声20min，然后置于高速冷冻离心机离心（20℃，12 000×g，10min），吸取上清液，置于真空干燥仪，浓缩干燥。处理完毕的样品密封保存于4℃。

1.7SDS-PAGE电泳分析血清去除HAP效果取经两种方法处理过的血清样品，加入适量超纯水复溶，然后进行SDS-PAGE电泳。

（1）组装电泳装置，并检查是否漏液。

（2）配制15%的分离胶（15ml）：蒸馏水3.4ml、30%丙烯酰胺溶液7.5ml、1.5mol/LpH为8.8的Tris溶液3.8ml、10%SDS0.15ml、0.006mlTEMED、10%过硫酸铵0.15ml，按照此顺序配胶，充分混匀即可。

（3）灌胶、液封：将配置好的分离胶沿长短板缝隙迅速灌入，灌胶高度约短板2/3处，不能产生气泡，然后加水液封，室温放置，待胶凝固后，弃去液封的蒸馏水，并用滤纸吸干残留液体［4］。

（4）配制5%浓缩胶（5ml）：蒸馏水3.4ml、30%丙烯酰胺溶液7.5ml、1.0mol/LpH为6.8的Tris溶液0.63ml、10%SDS0.05ml、0.005mlTEMED、10%过 硫 酸 铵0.05ml，按照此顺序配胶，充分混匀即可。

（5）灌胶并插入样品梳：将配置好的浓缩胶溶液迅速灌注在已凝固的分离胶上，并插入样品梳，不能产生气泡，室温放置，待浓缩胶凝固后，拔掉样品梳，安装电泳仪。

（6）加样、电泳：将处理好的样品与loading buffer按照4:1的比例，混合并置于95℃沸水浴5min后上样，每个加样孔加样10µl，未经处理的血清样品为对照组；然后电泳，电泳时，未进入分离胶时，电压为8V/ cm，进入分离胶后，电压调至15V/cm，直至指示剂到达分离胶底部，停止电泳。

（7）考马斯亮蓝染色：剥离凝胶，且标注第一个点样孔的位置，然后将其置于考马斯亮蓝染液染色，置于37℃恒温摇床，4h。

（8）脱色：弃去染色液，将凝胶置于脱色液脱色，每隔1h换一次脱色液，直至凝胶背景干净，条带清晰。

2　结果与分析

第1泳道为采用试剂盒去除肺癌患者血清HAP 的SDS-PAGE结果分析，第2泳道为采用试剂盒去除正常血清HAP的SDS-PAGE结果分析，第3泳道为采用乙腈沉淀法去除肺癌患者血清HAP的SDS-PAGE结果分析，第4-5泳道为采用乙腈沉淀法去除正常血清HAP的SDS-PAGE结果分析。M为蛋白Marker，第6-7泳道为未去除HAP的肺癌患者血清的SDS-PAGE结果分析，第8-9泳道为未去除HAP正常血清的SDSPAGE结果分析。从图示可以看出，采用试剂盒去除血清中的HAP和乙腈沉淀法去除效果几乎一样，且HAP去除后，原先被掩盖的LAP被显现，我们可以看到6.5kD以下LAP的条带。相比于原血清，80kD以上的HAP被明显去除，条带变窄。见图1。

图1　SDS-PAGE分析HAP去除效率

3　讨论

理想的蛋白质去除技术应该是具有选择性的，即能100%地去除会对低丰度蛋白质检测造成干扰的高丰度和中等丰度蛋白，同时对所需要研究的低丰度蛋白的含量及组成不产生影响或者能将影响降到最低；其次，这些技术每一次使用的投入，即所需要花费的成本（资金和时间）也是需要考虑的一个实际因素；另外，还需要考虑这些技术一次能够处理的样品量，多批样品处理时结果的重现性，以及与下游的蛋白质分析技术的兼容性等。

目前，常用于去除HAP的方法有有机溶剂沉淀法、亲和层析法、等电聚焦、超滤离心法等。本文采用依据亲和层析法原理制备的去除HAP的试剂盒，并联合超滤离心法去除HAP与有机溶剂乙腈沉淀法比较，发现：两种方法去除高丰度后与未去除高丰度蛋白的比较原先被掩盖的LAP被显现，我们可以看到6.5kD以下LAP的条带，两种方法去除HAP的效果几乎是一样的，但是对于试剂盒法，成本较高、样品处理量低、操作过程繁琐、耗时较长，但是乙腈沉淀法操作简便、成本低廉、稳定性强、重复性好、应用范围广，避免了物种和免疫原性的限制［5］。因此，乙腈沉淀法可作为去除HAP的首选方法。

近年来，肿瘤血清蛋白质组学是生命科学研究的热点领域，研究人员致力于从复杂的血清中发现并建立特异的疾病诊断模型。通过对肿瘤组与正常组间的血清蛋白质比较分析，找到肿瘤标志物，使它们有可能成为疾病的诊断，乃至早期诊断的分子标志物，以及新药物设计的分子靶点［6］。

机体内肿瘤细胞分泌的一些蛋白会进入血液，血清蛋白质组学的研究是蛋白质研究的一个重要分支。蛋白质组学研究中的HAP，清蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、触珠蛋白和脂蛋白等［7］，其总含量达血浆总蛋白质含量的97%-99%［8］。低丰度蛋白是指分子量＜10kD的蛋白质［9］，是能够反映疾病病理、生理等信息的重要蛋白质，常常会被高丰度蛋白所掩盖，因此，去除血清中的高丰度蛋白是血清蛋白质组学研究的首要任务。有效去除血清中的高丰度蛋白更为关键，有报道［10］乙腈法去除高丰度蛋白后经双向电泳有部分蛋白消失。这是本研究的一个不足，提示血清蛋白组学研究策略中，去除高丰度蛋白的同时，要注意考查可能损失的许多有价值的生物标志物信息。肺癌血清去除高丰度蛋白后显现的这些低丰度蛋白可以作为靶标进行肺癌血清未知肿瘤标志物的筛选，有望找到新的肺癌肿瘤标志物，筛选出其适配体，这是本课题今后努力的方向。

［1］孙立慧.肺癌血清肿瘤标志物的研究［J］.黑龙江医学，2012，36（5）: 352-355.

［2］李克，朱慧.离心超滤法去除血清大相对分子质量高丰度蛋白质的实验研究［J］.国际检验医学杂志，2011，32（20）:2359-2361.

［3］郭晓翔.固定化金属亲和磁性纳米粒子的制备及其纯化组氨酸标签蛋白质的研究［D］.成都:四川农业大学，2009.

［4］朱慧.肺癌血清蛋白质组学研究中高丰度蛋白质的去除及经HPLC分离后的图谱分析［D］.南京:南京师范大学，2011.

［5］曹璐颖，李克，郑文杰.甲醇沉淀法去除人血清高丰度蛋白质的实验研究［J］.医学研究生学报，2012，25（11）:1151-1154.

［6］邓开凤.利用乙腈与质谱技术筛选鼻咽癌相关血清标志蛋白质的研究［D］.南宁：广西医科大学，2011.

［7］Thadikkaran L，Siegenthaler MA，Crettaz D，et al Recent advances in blood-related proteomics［J］.Proteomics 2005，5（12）:3019-3034.

［8］苟黎明，邵小宝，李克.蛋白质组学研究中高丰度蛋白质去除方法的研究进展［J］.临床检验杂志，2010，28（4）:298-300.

［9］陈锋菊，张晓曦，宁丽红.有机溶剂沉淀法去除子宫内膜癌血清高丰度蛋白的比较研究［J］.湖南文理学院学报（自然科学版），2013，25 （3）:33-36.

［10］Muriel DB，Dominique DS，Marie-Alice M，et al.Comparison of three methods for fractionation and enrichment of low molecular weight proteins for SELDI-TOF［J］.Talanta，2010，82（1）:245-254.

Research on using two methods to remove the high-abundant proteins in serum of lung cancer

Ma Meilan1，Zeng Jiayu1，MaJin2，Yuan Hongxia2，Niu Tong1，Liao Shiqi2.

1.College of Life Science and Engineering，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China；2. Institute of Gansu Medical Science Research，Lanzhou 730050，China Corresponding author：Liao Shiqi，E-mail：Ishiqi5188@qq.com

Objective：We removed the high-abundant proteins in serum of lung cancer to lay the foundation for finding early markers of lung cancer.Methods：The albumin was precipitated by mixing delipidated serum，water，acetonitrile at ratio of 1:2:4.5（v/v/v）.The removal effects were analyzed by one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis（SDS-PAGE）.Results：The results showed that the average concentration of albumin in the serum was decreased.Compared with the gel images of the original serum with same volume，the band of protein with molecular weight between 50-80kD was removed.The band narrowed significantly and low-abundant proteins could be seen.Conclusion：The acetonitrile-depletion strategy may offer an economical，simple and reproducible method to remove album from human serum，which provided a technical support for further study of serum proteomics.

lung cancer；high-abundant proteins；low-abundant proteins

A

1004-2725（2016）01-0004-03

730070甘肃 兰州，西北师范大学生命科学学院（马梅兰、曾家豫、牛童）；730050甘肃 兰州，甘肃省医学科学研究院医学分子生物学研究中心（马瑾、袁红霞、廖世奇）

廖世奇，E-mail：lshiqi5188@qq.com