谭文影　李钟　张维维　李蕾　韩彬

野菊花不同炮制品提取物抑菌效果比较研究

谭文影李钟张维维李蕾韩彬

目的：比较野菊花鲜品与蒸制品的提取物对4种细菌抑菌作用的差异。方法：采用纸片法、稀释法以及空间抑菌法等进行抑菌试验。采用电导率法测定各样品对细菌电导率改变的差异。结果：各提取物对受试的4种菌均表现出一定的抗菌活性，鲜品醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最优，抑菌直径在11mm以上，最小抑菌浓度为0.125g/ml；鲜品挥发油对链球菌以及痢疾杆菌抑菌效果最优，抑菌直径11mm以上，最小抑菌浓度均为0.25%；空间抑菌法最优的是野菊花鲜品醇提物，杀菌率为91.41%。各提取物对上述细菌的培养基电导率均有影响，效果最优的是鲜品醇提物作用于痢疾杆菌5h，电导率增加18.2%（P＜0.05）。结论：不同炮制加工方法对野菊花的抑菌活性有影响，鲜品的炮制方法优于蒸制品。

野菊花；不同炮制方法；抑菌活性

药用野菊花为菊科植物野菊（Dendranthema indicum）的干燥头状花序，具清热解毒，疏散风热之功效［1］，常用于感冒、目赤、痢疾、痈肿疔疮的治疗，其抗菌成分主要为黄酮类物质、挥发油以及有机酸。花类中药的色泽和气味受日光照射后易变色变质，特别需要选择合适的加工方法［2-5］。我国野菊花分布广泛，加工炮制方法多样化，为防止花瓣散瓣和便于贮存等原因，常采用蒸法，而各地不同加工方法造成野菊花的质量参差不齐。本实验以广州番禺区的野菊花鲜品与蒸制品为目标，通过对抑制细菌的活性差异来比较不同的炮制方法，为野菊花的资源利用提供实验依据，也为花类中药的炮制加工提供依据。

1　材料与方法

1.1仪器与材料FA2204B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；HHS-4S电子恒温不锈钢水浴锅（余姚市上通温控仪表厂）；TDL80-2B离心机（上海安亭科学仪器有限公司）；SW-CJ-1F超净工作平台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；全自动高压蒸汽灭菌器（广州飞迪生物科技有限公司）；DDS-304电导率仪（上海雷磁仪器厂），康柏力熏蒸仪（中山康柏力）。鲜野菊花（采摘于广东广州番禺区，经广东药学院中药资源系李钟副教授鉴定为菊科的野菊花Dendranthema indicum）、蒸制野菊花（市售）。

1.2供试菌种本实验采用细菌4株，由广东药学院微生物教研室提供。大肠杆菌（Escherichia Coli）、痢疾杆菌（Shigella Castellani）、链球菌（Streptococcus）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）。

1.3培养基本实验采用固体培养基与液体培养基。供细菌实验用固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，配方为牛肉膏粉3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml。液体培养基为LB肉汤培养基，配方为蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖1g、酵母膏粉5g、蒸馏水1000ml。

1.4方法

1.4.1供试样品制备。精密称定鲜野菊花、蒸制野菊花各45g于圆底烧瓶中，各加入10倍量的75%乙醇，浸泡30min，于70℃下水浴回流2h，滤过，残渣再加入10倍量的75%乙醇回流1h，合并滤液，减压浓缩至无醇味待用。用相同体积的75%乙醇浓缩至无乙醇味的溶液作为抑菌试验空白对照。精密称定鲜品、蒸制品各200g于圆底烧瓶中，各加入10倍量的水，浸泡30min。水蒸气蒸馏法提取并收集挥发油。取上述挥发油各100ul溶于1ml的无水乙醇中配成10%的挥发油溶液待用。用相同体积的无水乙醇作为抑菌试验的空白对照。

1.4.2菌悬液的制备。将冻干菌种培育三代后调菌浓度至1.0×106-5.0×106cfu/ml待用。

1.4.3抑菌活性测定。将直径6mm的圆滤纸片放入各样品溶液中浸泡20min后取出，在无菌条件下晾干。将培养基倒入各平板中，每个平板约15ml，水平放置冷却后待用。将已制备好的各菌悬液用移液枪吸取0.1ml，分别注入相应的培养皿中，用已灭菌的涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面。用无菌镊子夹取上述晾干的含药滤纸片对号贴在含菌培养基表面，呈正三角分布，每菌每液做3个平行样，并做相应的空白对照。把做好的平皿放入培养箱中，细菌37℃下培养24h取出，测定抑菌圈直径，以产生抑菌圈的最小浓度为最低抑菌浓度［6］。

1.4.4最低抑菌浓度（MIC）的测定。用二倍稀释法将上述各样品分别稀释至10管，浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.39、0.195、0.0975mg/L。（原生药浓度）共10管浓度溶液。挥发油样品配制方法同上。然后向各浓度提取物肉汤中加入试验菌悬液并混匀，于37℃培养24h，以无菌生长的最低稀释度为提取物的最低抑菌浓度。

1.4.5空气抑菌试验法。采取平板沉降法进行空气抑菌试验。将上述醇提物（未浓缩）稀释至含醇量20%待用。选取10m3的房间，将上述醇提物放入蒸发仪中在40℃下熏蒸1h，分别于使用前和使用后在采样区放置平板，采样点选择实验空间四角和中央，平板在空气中暴露15min后密封，置于（36±1）℃恒温箱培养24 h，记录每个平板的菌落数。同理选取10m3的房间，内置100g粉碎的鲜野菊花或蒸制野菊花6h，让挥发油散开，采样方法同上。

1.4.6野菊花鲜品、蒸制品提取物对细菌培养基电导率的影响。取上述最低抑菌浓度的各样品液2ml加入等量肉汤中摇匀（每样品液制备12管，每组6管，设平行对照组），无菌条件下加入上述各菌液30μl于37℃下培养，并于0h、1h、2h、3h、4h、5h下离心（5000r/min，6min）取上清液测其电导率，设空白对照组。

2　结果

2.1野菊花鲜品、蒸制品提取物抑菌活性测定结果

由表1可知，野菊花各提取物对供试菌种都有不同程度的抑制作用，其中鲜品挥发油、蒸制品挥发油对链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，其抑菌圈直径达11mm以上，对大肠杆菌以及痢疾杆菌的抑制效果次之，其抑菌圈直径为9mm左右，醇提物的抑制效果相对较差。鲜品醇提物对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，其抑菌圈直径达9mm以上。

表1　野菊花各提取物抑菌圈直径

2.2野菊花鲜品、蒸制品提取物最低抑菌浓度实验结果表明各挥发油提取物对大肠杆菌、链球菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均有良好的抑制作用，0.5g/ml生药浓度下的鲜品醇提物与蒸制品醇提物对大肠杆菌均无抑制作用，对其他细菌有一定的抑制作用。见表2。

表2　野菊花不同炮制品提取液最低抑菌浓度

2.3空气抑菌试验法结果野菊花醇提物熏蒸消毒和挥发油散发消毒，对注射室内空气中自然菌均有不同程度的抑制作用。其中，鲜品醇提物抑制自然菌的效果最优，杀菌率为91.41%。鲜品挥发油与蒸制品挥发油杀菌率差异不大。见表3。

表3　各提取物空间抑菌试验结果

2.4鲜品、蒸制品提取物对细菌电导率的改变鲜品提取物、蒸制品提取物作用于大肠杆菌、链球菌、痢疾杆菌以及金黄色葡萄球菌后培养液电导率的变化测定如图1。胞外电导率的变化缘于菌体细胞膜通透性的改变引起了K+、Na+、Ca+等离子的外漏。各提取物作用于菌体初期时，上清液的电导率随着时间的增大而增大。鲜品醇提物作用菌体5h后，大肠杆菌电导率为0.4450，链球菌电导率为0.3547，痢疾杆菌电导率为0.2440，金黄色葡萄球菌电导率为0.5410；蒸制品醇提物作用5h后，大肠杆菌电导率为0.4500，链球菌电导率为0.3510，痢疾杆菌电导率为0.2500，金黄色葡萄球菌电导率为0.5470；鲜品挥发油作用菌体5h后，大肠杆菌电导率为0.4570，链球菌电导率为0.3660，痢疾杆菌电导率为0.2530，金黄色葡萄球菌电导率为0.5540；蒸制品挥发油作用菌体5h后，大肠杆菌电导率为0.4640，链球菌电导率为0.3490，痢疾杆菌电导率为0.2599，金黄色葡萄球菌电导率为0.5510。上述数值与0h时相比，提示各提取物对上述细菌的细胞膜通透性均有影响。加药组电导率与对照组相比增加最为明显的是鲜品醇提物作用于痢疾杆菌，电导率增加了18.2%（P＜0.05），其次为鲜品挥发油作用于链球菌，电导率增加为5.88%（P＜0.05）。

图1　野菊花不同炮制品提取液对菌体细胞膜影响的分析

3　讨论

中国药典记载野菊花的炮制方法为晒干或蒸后晒干，大部分药农都会采用上述方法来加工野菊花。但蒸制过程中火候的大小与蒸制时间的长短均会影响野菊花的内在质量，市场上又缺乏严格的、可控的技术规范，也无科学、可行的工艺操作SOP，药农仅凭经验而无客观标准［7-9］，因此，市场上的野菊花质量良莠不齐。在炮制的过程中，抑菌的有效成分例如黄酮、绿原酸、挥发油以及苷类会发生一定的变化，这种变化在其抑菌活性水平上有一定的体现［10，11］。本实验从抑菌活性、最低抑菌浓度、空间抑菌活性等四个方面对比了野菊花鲜品和蒸制品之间的抑菌差异，大体上显示鲜品醇提物、挥发油的抑菌活性优于蒸制品，提示鲜品药用效果优于蒸制品，但是鲜品不利于贮存和运输，期望有更科学可控的野菊花加工炮制方法。

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Antibacterial activity of different processed products of Dendranthema indicum

Tan Wenying，Li Zhong，Zhang Weiwei，Li Lei，Han Bin.College of Traditional Chinese Medicine of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China Corresponding author：Han Bin，E-mail：hb1299cn.com

Objective：To evaluate the different antibacterial activity between fresh and the streamed Dendranthema indicum extracts against four bacterias.Methods：The antibacterial activity of the extracts againsted bacterias was identified by disk diffusion，slips method and antibacterial test on the space in vitro.Used the conductivity meter to measure the values in different time periods.Results：The extracts showed a certain antibacterial activity.Fresh Dendranthema indicum ethanol extract showed a best antibacterial activity on Staphyloccocus aureus Rosenbach and its mic was 0.125g/ml，the antibacterial circle was above 11mm；Fresh Dendranthema indicum oil showed a better effect on Streptococcus and Shigella Castellani，the mic of them were 0.25%，the antibacterial circle was above 11mm；All extracts could damge bacterial membrane，but the fresh Dendranthema indicum ethanol extract was the better against Shigella Castellani，for its conductivity was increased by 18.2%（P＜0.05）.Conclusion：Differet products have a effect on its antibacterial activity，the processing technology of the fresh product is better than the streamed.

Dendranthema indicum；different processing technology；antibacterial mechanism

A

1004-2725（2016）01-0001-04

510006广东 广州，广东药学院中药学院

韩彬，E-mail：hblz99@21cn.com