林勤，徐文雅，董斌，陈艳芬，赵越（广东药科大学中药学院，广东广州510006）

响应面法优化类球红细菌中辅酶Q10超声提取工艺

林勤，徐文雅，董斌，陈艳芬，赵越
（广东药科大学中药学院，广东广州510006）

目的优选类球红细菌中辅酶Q10的最佳超声提取工艺。方法采用HPLC法测定辅酶Q10质量浓度，以菌体中辅酶Q10的质量浓度作为响应值，在单因素试验基础上，选择超声波输出功率、超声波每次提取时间和超声波每次辐射时间这3个因素进行响应面试验设计。结果类球红细菌中辅酶Q10的最佳超声提取工艺条件为:超声波输出功率为250 W，超声波每次提取时间为10 min，超声波每次辐射时间为8 s。在该条件下，辅酶Q10质量浓度的预测值为11.535 1 μg/mL，实测平均值为11.451 8 μg/mL。结论本文所得工艺方法切实可行，为类球红细菌发酵生产辅酶Q10的进一步研究提供参考。

类球红细菌；辅酶Q10；提取工艺；响应面法

辅酶Q10广泛存在于自然界，是细胞呼吸链上的一种递氢体［1］。辅酶 Q10具有长的异戊二烯侧链，易溶于正己烷、三氯甲烷、苯、四氯化碳，溶于丙酮、石油醚及乙醚，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇，在光照下易分解呈微红色，对温度和湿度较稳定［2］。辅酶Q10具有治疗充血性心力衰竭［3］、降压［4］、抗肿瘤、保护心血管等功效，还作为抗氧化剂用于化妆品中以延缓皮肤衰老［5-7］。

目前，辅酶Q10的提取制备普遍采用醇碱皂化法和有机溶剂萃取法［8］，但这些传统提取方法对于辅酶Q10的损失较大。辅酶Q10在生物体内通过醌环亚层电子的范德华力相连［9］，超声波破碎法提取类球红细菌菌体的辅酶Q10，是利用声波高加速度、加速介质质点运动和空化效应，可提高目标物从固相转移到液相的传质速率，促进目的产物进入溶剂。

本文参考李德和等［10］采用HPLC法测定类球红细菌中辅酶Q10质量浓度的方法，以丙酮作为提取溶剂，超声破碎辅助提取辅酶Q10，并进一步采用Box-Behnken响应面试验设计方法［11-13］优化超声提取工艺。在优化过程中，以辅酶Q10质量浓度为指标响应值，选取超声波输出功率、超声波每次提取时间和超声波每次辐射时间这3个影响因素用于考察辅酶Q10的最佳提取工艺，克服了正交试验只能对孤立点进行分析而不能给出直观图形的缺点，为类球红细菌发酵生产辅酶Q10提供参考［14］。

1　仪器与材料

BP-211D 211D电子天平（德国Sartorius公司）；AY-120电子天平（日本Shimadzu公司）；3-30KS离心机（德国Sigma公司）；SCIENTZ-II D超声波细胞粉碎机（宁波新芝超声仪器有限公司）；RV10 basic旋转蒸发仪（德国IKAIKA公司）；SHB-Ⅲ循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DLSO-5/20低温冷却循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；UV-2450紫外-可见分光度计（日本岛津公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DIKMA platisil ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（天津迪马公司）；MJ-78A高压灭菌锅（美国Stik公司）；SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；RXZ人工气候箱（宁波江南仪器厂）。

类球红细菌（编号:1.2174，中国科学院微生物研究所）；辅酶Q10对照品（中国食品药品检定研究院）；无水乙醇（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，瑞典Oceanpak公司）；水为屈臣氏蒸馏水；酵母膏为国产生物纯；其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1HPLC法测定类球红细菌中辅酶 Q10质量浓度［10］

2.1.1色谱条件 色谱柱:DIKMA Platisil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相:甲醇-无水乙醇（体积比20∶80），检测波长:275 nm，柱温:35℃，进样体积:10 μL，流速:1 mL/min。

2.1.2标准曲线的绘制 精密称取辅酶Q10对照品1.6 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀得到32.0 μg/mL的对照品溶液。精密吸取0.5、1、3、5、7、10 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀分别得到1.6、3.2、9.6、16、22.4、32.0 μg/mL的对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样10 μL，以峰面积（A）对质量浓度（ρ）作线性回归，得回归方程A=4 240.3ρ+172 01，R2=0.999 7（n=6），表明辅酶Q10质量浓度在1.6～32.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.3供试品溶液的制备

2.1.3.1 菌种的扩大培养 培养基配方:无水乙酸钠3.0 g，（NH4）2SO41.0 g，酵母膏2.0 g，CaCl20.05 g，MgSO40.2 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.7 g，微量元素液4 mL，维生素液1 mL，纯化水1 000 mL。类球红细菌培养液的配制:配制1 000 mL培养基，121℃灭菌20 min，接入对数期菌种，于实验室人工气候箱中培养6 d，即得。

2.1.3.2 类球红细菌中辅酶Q10的提取［10］取类球红细菌培养液50 mL，3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，获得的菌体用生理盐水洗涤2次，以此获得湿菌体，然后加入丙酮10 mL充分混匀，避光超声破碎辅助提取10 min，3 000 r/min离心收集上清液，残渣重复2次，合并3次上清液于旋转蒸发仪蒸干，加无水乙醇定容至10 mL。

2.1.4专属性考察［15］选用“2.1.2”项下质量浓度为16 μg/mL的辅酶Q10对照品溶液及“2.1.3.2”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，进样10 μL进行分析。结果，辅酶Q10与相邻峰分离度均大于1.5，理论塔板数按辅酶Q10计不小于5 000。色谱图见图1。

图1　辅酶Q10对照品（A）和样品（B）的高效液相色谱图Figure 1 HPLC Chromatograms of CoQ10control（A）and samples（B）

2.1.5 方法学考察 取“2.1.3.2”项下供试品溶液10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下连续进样6次，测得辅酶Q10的峰面积RSD为1.13%，表明仪器精密度良好。然后，再分别于2、4、6、8、12、24 h进样，在相同条件下测得辅酶Q10峰面积RSD为0.95%，表明供试品溶液在24 h内稳定。取同一批类球红细菌辅酶Q10提取液，在“2.1.1”项色谱条件下测定，测得平均质量浓度为3.466 μg/mL，RSD为0.62%。加样回收率试验测得辅酶Q10平均回收率为99.18%，RSD为3.41%，表明方法准确可靠。

2.2响应面法试验设计

在单因素试验的基础上，选取超声波输出功率、每次提取时间和每次辐射时间为考察因素，以辅酶Q10质量浓度为响应值（Y），采用Design-Expert 8.0.6软件，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理设计3因素3水平的响应面试验，共有17个试验，其中12个为析因试验，另外5个为中心试验，用于估算误差，见表1～表2。

表1　响应面法试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface

2.3建立模型及显著性检验

采用Design-Expert 8.0.6响应面软件，对表2中17个辅酶Q10质量浓度的数据进行线性回归拟合，得到二次多项回归方程Y=-11.968 41+2.675 94X1+ 0.021 312 X2+0.623 89X3-0.003 127 5X1X2-0.091 146X1X3+0.006 7487 5X2X3-0.059 218X1

2-0.000 022 885X22-0.072 053，然后进行方差分析，结果见表3。可见，模型达到了极显著水平（P＜0.001），即各因素与响应值之间的关系非常显著，失拟项也显著（P＜0.05）；相关系数R2=0.961 4，校正相关系数R2Adj=0.911 7，说明数据具有一定可靠性；信噪比16.780＞4，可知回归方程的拟合度和可信度均较高。综上所述，该回归方程能很好地对响应值进行预测。

表2　响应面试验设计方案及结果Table 2 　Design scheme and results of response surface experiment

表3　模型方差分析Table 3 ANOVA of model

2.4响应曲面的分析

采用Design-EXpert 8.0.6响应面软件，分析超声波每次提取时间、超声波输出功率和超声波每次辐射时间之间的交互作用对辅酶Q10质量浓度的影响，分别得到相互因素的二次多项回归方程:当去掉回归系数X3时，Y=-11.425 76+2.169 52X1+0.064 231X2-0.003 127 5X1X2-0.060-0.000 028 952；当去掉回归系数 X1时，Y=+ 10.689 82-0.011 730X2-0.385 71X3+0.006 748 75X2X3-0.000 034 105-0.079 066；当去掉回归系数X2时，Y=-8.720 88+2.058 47X1+1.982 67X3-0.091 146X1X3-0.059-0.072 806。根据以上方程绘制响应曲面图见图2。可见，以上3种因素对辅酶Q10质量浓度的影响次序为超声波输出功率（X2）＞超声波每次提取时间（X1）＞超声波每次辐射时间（X3），这与表3的方差分析结果相符。

图2　各因素交互作用的响应曲面图Figure 2 Response surface analysis of the interaction of each factor

2.5辅酶Q10最佳提取工艺

利用Design-expert 8.0.6模拟得出的类球红细菌中辅酶Q10最优提取工艺为超声波输出功率250 W、超声波每次提取时间9.84 min和超声波每次辐射时间 8 s。所得辅酶 Q10质量浓度的预测值为11.535 1 μg/mL。为了验证响应面法结果的可靠性，从实际生产出发，设定超声波输出功率250 W、超声波每次提取时间10 min和超声波每次辐射时间8 s，在此条件下进行3次平行验证试验，得到的辅酶Q10质量浓度实际平均值为11.451 8 μg/mL，RSD为0.896%。实际值与预测值相比误差仅为0.724 8%，相差较小，说明模型是可行的，响应面法优化得到的辅酶Q10提取工艺具有实际生产价值。

3　讨论

本试验前期选取了超声波输出功率（100、150、200、250、300 W）、超声波每次提取时间（6、9、12、15、18 min）和超声波每次辐射时间（2、4、6、8、9.9 s）这3个因素进行单因素试验。单因素试验结果显示，各因素的最佳范围为:超声波输出功率150～250 W，超声波每次提取时间9～15 min，超声波每次辐射时间4～8 s。使用响应曲面法建立数学模型，利用模型的响应曲面图得到优化的工艺条件为:超声波输出功率250 W、超声波每次提取时间9.84 min和超声波每次辐射时间8 s，在此条件下，辅酶Q10质量浓度的理论值为11.535 1 μg/mL，均高于工艺优化前（8.712 60 μg/mL）及文献［10］报道的5.914 μg/mL。

响应面试验结果显示，超声波输出功率与超声波每次提取时间显著影响辅酶Q10的提取率，经二次多项回归模型，得到了最佳提取工艺，且实测值与预测值吻合，说明了Box-Benhnken的中心组合试验设计具有良好的可行性，并且响应面法能较好地对类球红细菌中辅酶Q10的超声提取工艺参数进行优化，也为利用类球红细菌生物转化斑蝥获得抗氧化效果更显著的保健品研究奠定了基础。

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（责任编辑：陈翔）

Optimization of extraction conditions for coenzyme Q10from Rhodobacter sphaeroides by surface response methodology

LIN Qin，XU Wenya，DONG Bin，CHEN Yanfen，ZHAO Yue
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the extraction conditions of coenzyme Q10from Rhodobacter sphaeroides by surface response methodology.Methods The concentration of coenzyme Q10was set as response value，based on single factor experiments，and the response surface methodology was used to study the effects of ultrasonic power，ultrasonic extraction time at a time and ultrasonic radiation time at a time on the extraction rate of coenzyme Q10.The content of coenzyme Q10was determined by HPLC.Results The optimal extraction conditions were as follows:ultrasonic power 250 W，ultrasonic extraction time at a time 10 min and ultrasonic radiation time at a time 8 s，under these conditions，the prediction value of coenzyme Q10was 11.535 1 μg/mL and the measured value was 11.451 8 μg/mL.Conclusion The experimental process is feasible，which can provide technical reference for the further research of coenzyme Q10in Rhodobacter sphaeroides.

Rhodobacter sphaeroides；coenzyme Q10；extraction；surface response methodology

R284.3

A

1006-8783（2016）04-0420-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041903

2016-04-19

国家自然科学基金项目（81374072）

林勤（1991—），女，2014级硕士研究生，Email:731987501@qq.com；通信作者:赵越（1955—），女，教授，从事中药新剂型与新技术、中药物质基础和质量标准研究，Email:zybmbylk688@163.com。

网络出版时间:2016-07-011 15:02 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1502.008.html