吕　新，陈丽华，李玥仁

(福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所；精密仪器农业测试重点公共实验室　350003)



一种利用碱裂解法快速筛选重组子的方法

吕新，陈丽华，李玥仁

(福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所；精密仪器农业测试重点公共实验室350003)

根据碱裂解法提取质粒DNA的原理，利用碱裂解法快速筛选到重组子，该方法快迅、准确，可应用于基因克隆中的重组菌落快迅检测。

碱裂解法；重组子；快速；筛选

基因克隆是现代分子生物学中一种重要的技术手段。在基因克隆中，目的基因和载体在体外连接形成重组DNA质粒后，将重组DNA质粒和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA质粒进入大肠杆菌中，实现重组DNA质粒的转化，并在含有抗生素的LB琼脂平板培养基上形成重组子菌落。目前，筛选重组子主要采用遗传表型检测法、限制性酶切法和菌落PCR法，但在实际操作中均存在不尽人意的地方。在遗传表型检测过程中，α互补检测中必须加入的呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(x-gal)和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)价格昂贵，大量筛选势必增加实验成本；限制性酶切法需对数10个菌落进行培养后提取质粒进行酶切检测，非常费力，甚至使用限制性酶切法常找不到适合用2种或2种以上限制性内切酶的缓冲液，必须分步进行酶切反应；菌落PCR法反应易受环境污染造成假阳性，反应条件不合适易造成假阴性，且若没有可以利用的引物，还需合成引物。鉴于上述问题，笔者在碱裂解法提取质粒DNA方法的基础上[1]，研究出一种操作简便、方法快速、结果可靠的重组子快速筛选方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与载体pBluescriptSK(+)质粒(3.0 kb，Amp抗性)，DH5α。外源插入片段0.7 kb和1.0 kb，由福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所克隆完成。

1.1.2试剂与仪器试剂：Tris、EDTA、RNaseA、SDS、NaOH、溴酚蓝、蔗糖。仪器：电泳仪及电源(北京六一仪器厂)。LB固体培养基、液体均按常规方法配制。

1.2方法

插入片段的连接、转化按萨姆布鲁克等[8]的方法进行，37℃倒置培养过夜，待菌落在LB平板上生长至2～3 mm时，按如下步骤操作：取8 μL悬浮液(50 mmol/L Tris pH 8.0、10 mmol/LEDTA、0.1 mg/mL RNaseA、0.1%溴酚蓝)加入到1.5 mL离心管中，再在超净台内用10 μL枪头随机挑取LB平板上10个待检测菌落，在悬浮液中用移液枪反复吹打混匀，然后加入8 μL裂解液(200 mmol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖)，轻柔吹打混匀，避免产生过多气泡(容易变得黏稠)，室温放置3 min，最后取10 μL裂解产物，在1%琼脂糖凝胶上、110 V电压下电泳30 min后，使用凝胶成像仪对琼脂糖凝胶拍照，根据质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳时迁移距离的差异，判断是否为重组子菌落。

2　结果与分析

2.1快速检测结果分析

待检测重组子菌落质粒DNA在琼脂糖电泳后显色，可观察到4条不同电泳位置的DNA条带，其中第2个条带在重组菌落与非重组菌落间存在明显的位置差异，其他3个条带不存在位置差异。由于重组菌落带有700 bp或1000 bp的插入片段，其质粒DNA与非重组质粒DNA片段相比较大，在相同时间的琼脂糖电泳时迁移的速率较慢，导致2种不同质粒DNA间的位置差异(图1、图2)。

2.2优缺点分析

目前对于重组子菌落的筛选主要采用遗传表型检测法、限制性酶切法和菌落PCR法。本方法与上述3种方法比较，具有如下优点：①检测方法迅速，只要简单3步，可以在1 h内完成并获得结果；②结果可靠，根据重组质粒DNA与非重组质粒DNA片段大小差异来区分，有效避免PCR法检测出现假阳性和假阴性的问题[2]；③操作简单，不要求特殊仪器设备，只需1个琼脂糖电泳仪即可，一般的分子生物学研究室均具备；④成本低廉，不需要昂贵的X-gal和IPTG试剂[3-7]，可大幅减少检测成本。

但本方法也具有一定的局限性，如插入片段必须大于200 bp，才能在1%琼脂糖电泳时观察到重组子质粒DNA与非重组质粒DNA之间明显的滞后现象；无法直接判断插入片段方向。

3　小结

本方法根据碱裂解法提取质粒DNA的原理，将待检测重组子菌落悬浮在悬浮液，在裂解液提供的碱性环境下快速裂解待检测菌落，并释放质粒DNA。由于重组质粒DNA片段较大，在琼脂糖凝胶电泳时迁移速度较慢，而非重组质粒DNA片段较小，在琼脂糖凝胶电泳时迁移速度较快，因此可根据质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳时迁移距离的差异，判断是否为重组子菌落。

悬浮液中Tris为质粒DNA释放时提供稳定的pH缓冲环境；EDTA可以螯合重金属离子，并抑制DNA酶活性；RNaseA可去除质粒DNA中的RNA污染；溴酚蓝在电泳检测时起条带指示作用。裂解液中NaOH为质粒DNA释放时提供碱性环境，同时NaOH和SDS能裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒DNA；蔗糖可增加比重，浓缩质粒DNA，使点样后的质粒DNA能够沉于点样孔中。

此技术操作简便、方法快速，能在1 h内完成待检测菌落的检测和判断，且检测过程中不需要x-gal和IPTG等昂贵试剂，结果的准确性高于PCR法，检测时间比常规限制性酶切法大幅减少。可应用于基因克隆中重组菌落快速检测，特别是在大量筛选重组菌落时将大幅减少筛选的时间和检测成本。

[1]BIRNBOIM H C,DOLY J.A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA[J].Nucleic Acids Res,1979,7(6):1513-1523.

[2]田丽春，黄光瑞，陈亮，等.一种快捷可靠的大肠杆菌重组质粒筛选方法[J]. 湖北大学学报：自然科学版,2008(2):202-204.

[3]ITOH M,CARNINCI P,NAGAOKA：S,et al.Simple and rapid preparation of plasmid template by a filtration method using microtiter filter plates[J].Nucleic Acids Res，1997,25(6):1315-1316.

[4]张桂敏，刘振，李春华，等.一种简便快速筛选重组子的方法[J].湖北大学学报：自然科学版,2005(3):280-281.

[5]崔锦，李林珂，马向东.一种简便快速筛选重组子的方法[J].生物技术,2005(6):46-47.

[6]罗文永，陈建伟，刘彦卓，等.快速鉴定阳性重组质粒方法的改进试验[J].广东农业科学,2004(2):9-10.

[7]CHOWDHURY E H,AKAIKE T.Rapid isolation of high quality， multimeric plasmid DNA using zwitterionic detergent[J].Journal of biotechnology,2005,119(4):343-347.

[8]萨姆布鲁克，鲁塞尔，培堂.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社,2002.

(责任编辑：林芸菁)

A rapid screening method of recombinant methods by using alkaline lysis

LV Xin, CHEN Li-hua, LI Yue-ren

(InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyofFujianAcademyofAgriculturalSciences;PrecisionInstrumentKeyPublicLaboratoryforAgricultureTest,FujianProvince350003)

According to the principle of alkaline lysis method for extracting plasmid DNA, the recombinants were rapidly screened by using the alkaline lysis method, which is quick and accurate and can be applied in rapid detection of recombinant bacterial colonies in gene cloning.

Alkaline lysis method; recombinant; fast; screening

2016-04-25

吕新，男，1980年生，助理研究员。

李玥仁，男，1966年生，研究员(E-mail:yuerenli@yeah.net)。

福建省公益类青年科研项目(2014R1025-5)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.05.005