盛　莉,康延海

(海南省人民医院 肿瘤内科一区,海南 海口570311)



生脉注射液联合表阿霉素对肝癌细胞HepG-2表阿霉素敏感性的影响

盛莉,康延海

(海南省人民医院 肿瘤内科一区,海南 海口570311)

表阿霉素是一种抗生素类抗肿瘤药物，临床应用广泛，可用于胃癌、肝癌、恶性淋巴瘤等疾病治疗。该药物通过抑制胞内遗传物质增殖来发挥功效，肝癌是我国最常见的恶性肿瘤，HepG-2是肝组织的肿瘤细胞，有效抑制该细胞的增值是肝癌病情控制的关键。相关报道[1]指出单一化疗药物容易使患者产生耐药性，且不良反应较多，目前联合用药抑制肝癌细胞增值成为临床应用热点。生脉注射液是从传统经典方剂生脉饮基础上制成的中成药，多数研究[2,3]提示其联合化疗药物可提高机体免疫功能，减轻毒副反应。本研究探讨生脉注射液联合表阿霉素对肝癌细胞HepG-2表阿霉素敏感性的影响，现报道如下：

1　材料与方法

1.1研究材料

试剂：RPMll640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、猪胰蛋白酶(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，注射用盐酸表柔比星(表阿霉素，辉瑞制药有限公司)，生脉注射液(山西太行药业股份有限公司)，噻唑蓝(MTT，美国AMRESCO公司)，凯基AnnexinV-FITC检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)。主要仪器：酶标仪(奥地利安托斯仪器公司)，流式细胞仪(美国DB公司)。细胞株：人肝癌HepG-2细胞株(中国科学院上海细胞库)。

1.2方法

1.2.1细胞培养将肝癌HepG-2细胞放于100ml/L小牛血清、100Μ/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基，置于37度恒温培养箱中，细胞单层贴壁生长，长至80%-90%用猪胰蛋白酶溶液消化传代，取对数生长期细胞进行相关试验。

1.2.2流式细胞法取对数生长期肝癌HepG-2细胞，将其接种于24孔板，培养24h，将细胞分成对照组(正常条件)、给药1组(30μl/ml生脉注射液)、给药2组(0.03μg/ml表阿霉素)、给药3组(30μl/ml生脉注射液+0.03μg/ml表阿霉素)，仅需培养24h，收集细胞，根据试剂盒操作说明处理细胞，流式细胞仪观察检测细胞凋亡率。

1.2.3MTT试验取对数生长期的肝癌HepG-2细胞，用猪胰蛋白酶进行消化，将DMEM稀释成单细胞悬液，调整细胞密度5×104/ml，将其接种于96孔板，培养24h，将培养基去掉，对照组(正常培养)，给药1组(生脉注射液，体积分数0、10、20、50、100、200μl/ml)，给药2组(表阿霉素作用HepG-2细胞，浓度0、0.2、0.6、1.8、5.4μg/ml)，给药3组(30μl/ml生脉注射液联合浓度0、0.2、0.6、1.8、5.4μg/ml表阿霉素)，培养72h，每孔加入20μl5mg/mlMTT，培养4h，弃掉孔中培养基，加150μlDMSO，震荡10min，酶标仪测定吸光度(492nm)。每组重复试验5次，计算药物IC50值。

1.3统计学分析

2　结果

2.1凋亡作用

对照组24h存活HepG-2细胞92.8%，给药1组、2组和3组药物作用24h后存活HepG-2细胞分别占93.6%、58.5%、35.4%，给药2组和3组细胞存活率明显少于给药1组和对照组(P<0.05)，给药1组同对照组比较无显著性差异(P>0.05)，见表1。

2.2增敏效果

单用表阿霉素作用的IC50为(0.043±0.013)/(μg·ml-1)，联合生脉注射液后表阿霉素IC50(0.003±0.001)/(μg·ml-1)，增效约14倍，具体见表2。

表1　生脉注射液联合表阿霉素对肝癌 HepG-2 细胞凋亡作用

表2　生脉注射液对表阿霉素作用于肝癌细胞HepG-2的增敏效果

3　讨论

通过MTT试验发现生脉注射液对HepG-2有一定抑制作用，但需较高药物体积分数才能发挥抑制效果，低体积分数生脉注射液对肿瘤细胞存活无显著性影响，该结果和李斌[4]文献中所得到的结果相一致。已有报道[5]对生脉注射液的增效减毒作用进行了研究，发现其在不同肿瘤细胞中的增效作用各异。

本研究探讨了生脉注射液对表阿霉素的增敏作用。通过流式细胞分析，单用生脉注射液细胞凋亡率4.7%，同正常培养的细胞凋亡率无明显差异，该结果说明低体积分数生脉注射液对HepG-2细胞的伤害微小。单用表阿霉素作用HepG-2细胞，细胞凋亡率40.5%，可证实表阿霉素对HepG-2细胞有较好的杀伤作用，可促进细胞凋亡。表阿霉素作用机制是嵌入到脱氧核糖核酸碱基对之间，以此来干扰DNA转录，对信使RNA的形成受到抑制，同时还可以抑制拓扑异构酶Ⅱ[6]，是治疗肝癌的重要药物之一。生脉注射液联合表阿霉素作用HepG-2细胞，细胞凋亡率达到64.1%，提高约20%，说明生脉注射液可能促进了表阿霉素抑制肿瘤增值的作用。生脉注射液的主要成分是红参、麦冬、五味子，红参主要含人参皂苷，相关研究指出人参皂苷对人肝癌细胞具有诱导分化作用，Rh2可抑制癌细胞扩散[7]，增强机体免疫功能，同时可改善心肌功能。而表阿霉素的主要毒副作用是心肌伤害[8]，其正好用以减轻该伤害。麦冬主要含多种甾体皂苷，其主要用于抗肿瘤、抗辐射、免疫调节等方面。五味子主要含联苯环辛烯类物质，主要是五味子乙素，五味子乙素可上调细胞抗氧化防御机制，广泛保护机体组织。相关研究[9]指出人参皂苷Rb1和五味子乙素可改变P-gp蛋白表达，逆转肿瘤细胞耐药性，适合配伍抗肿瘤药物使用。生脉注射液成分的上述作用提示其对抗肿瘤药物可能有好的增敏作用，研究进一步分析了生脉注射液对表阿霉素的增敏作用，配伍用药后表阿霉素的IC50值明显降低，增效近14倍，说明配伍生脉注射液后，提示小剂量的表阿霉素就可以达到杀灭肿瘤细胞的作用，这样就可以减少表阿霉素的用药剂量，减轻不良反应，这对肝癌患者的临床治疗有重要的意义。表阿霉素作为抗肿瘤的有效药物，疗效较好，但心肌毒性较大，限制了其在临床上的应用[10]。

[1]苗苗，李嵚，刘雅茹.生脉注射液对不同化疗药物的增敏作用[J].中草药，2013，44(7):875.

[2]王伟，姚朝辉.生脉注射液对晚期非小细胞肺癌患者化疗毒副反应及免疫功能的影响[J]．临床肺科杂志,2012,17(5):876.

[3]张力，龚明玉，李毅学，等．放疗联合热疗诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其与Bcl-2和Bax蛋白表达关系的研究[J]．中国全科医学，2011，14(20)：627．

[4]李斌.干扰TIGAR基因增强肝癌细胞对表阿霉素化疗敏感性的机制研究[D].郑州大学附属二院，2011.

[5]YinQH,YanFX,ZuXY,etal.Anti-proliferativeandpro-apoptoticeffectofcarvacrolonhμmanhepatocellμlarcarcinomacelllineHepG-2[J].Cytotechnology,2012,64(1):43.

[6]凌华毓，顾康生．尼妥珠单抗联合表阿霉素对人肝癌细胞株HepG2体外生长的影响[J].临床肿瘤学杂志，2011，16(2) ：113.

[7]WangB1,Xμnsun,LiuJY,etal.TheeffectofcellcycleandexpressionofcyclinB1andcyclinCproteininhepatocellμlarcarcinomacelllineHhepG2andSMMC-7721aftersilencingβ-cateningene[J].Hepatogastroenterology,2012,59(114):515.

[8]肖广显，丁素银，程英俊，等．索拉非尼联合热疗对肝癌HepG-2细胞中Bax，Bcl-2表达的影响[J]．解放军医药杂志，2011，23(5)：1.

[9]朱开梅，李美波，骆彩珍，等.构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞增殖及其细胞周期的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014,20(3):153.

[10]VanGeelenCM,PennarunB,EkWB,etal.Downregulationofactivecaspase8asamechanismofacquiredTRAILresistanceinmismatchrepair-proficientcoloncarcinomacelllines[J].IntJOncol,2010,37(4):1031．

海南省自然科学基金(SQ2014ZRJJ0136)

1007-4287(2016)08-1325-02

2016-02-18)