张伟刚 谢芳 何扬 钱海鑫⋆

核受体共激活因子NCOA5单克隆抗体的制备及其在乳腺癌中的表达研究

张伟刚 谢芳 何扬 钱海鑫⋆

目的 探讨核受体共激活因子NCOA5单克隆抗体在诊断人乳腺癌中的应用。方法 应用小鼠杂交瘤技术制备能够识别NCOA5蛋白的单克隆抗体，利用该抗体采用免疫组化检测100例乳腺浸润性导管癌中NCOA5的表达。结果 成功制备能够特异识别野生型NCOA5的单克隆抗体8B11，用于乳腺癌标本检测发现，随着肿瘤的增大，NCOA5的阳性表达率升高（P=0.008）；在有淋巴结转移组中，NCOA5的阳性表达率升高（P=0.042）；随着肿瘤TNM分期的增加，NCOA5的阳性表达率逐渐上升（P=0.028）；NCOA5在ER阴性标本中阳性表达率显著升高（P=0.006）；NCOA5在PR阴性标本中阳性表达率升高（P=0.025）；NCOA5表达与年龄、组织学分级、HER-2差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 利用杂交瘤技术成功制备一株效价高、特异性好单克隆抗体8B11；NCOA5在乳腺癌中阳性表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及ER、PR的表达水平相关，可为乳腺癌的诊断及治疗提供一定依据。

NCOA5 单克隆抗体 特异性 乳腺癌

乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，世界范围的女性肿瘤患者中，发病率23%，病死率14%［1］。研究表明，长期暴露于内源性激素，是乳腺癌发生的重要病因［2］，其中雌激素受体ERα的表达水平是决定乳腺癌治疗方式和评价预后的重要指标［3］。核受体共激活因子5（NCOA5），能在配体调节的情况下与雌激素受体ERα和ERβ形成复合物，并增强ERα转录活性［4］。还能作为其他转录因子的共调节因子发挥作用［5～7］。2014年3月至2015年3月作者通过杂交瘤技术［8］制备一株识别NCOA5的单克隆抗体，并将该抗体应用于检测NCOA5在乳腺癌标本中的表达，分析其与相关临床病理指标的关系。

1 材料与方法

1.1 材料、实验动物及试剂 原核表达载体质粒pET-41a及 Ni-NTA镍离子纯化柱购自美国Novagon公司［9］，克隆用大肠杆菌TOP10及表达用BL21（DE3）由苏州大学唐仲英血液研究中心提供；骨髓瘤细胞Sp2/0，乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系HepG2为苏州大学唐仲英血液研究中心保存；6～8周龄BALB/ c小鼠购自苏州大学医学院实验动物中心；弗氏佐剂、HAT、PEG购于 SIGMA 公司；胎牛血清购自Gibco公司；DMEM、RPMI1640高糖培养基购自Thermo Fisher公司；商品化抗NCOA5多抗购自美国abcam公司。

1.2 单克隆抗体的制备与鉴定 通过检索NCBI Gene Bank 公布的人类基因NCOA5序列设计合成NCOA5 C端的引物，利用PCR扩增NCOA5 C端基因片段，连接表达质粒pET41a进行原核表达，通过Ni-NTA柱纯化重组蛋白并免疫小鼠。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞经由PEG融合，间接法ELISA筛选稳定分泌抗NCOA5抗体的杂交瘤细胞，诱生腹水法收集抗体并使用ProteinG亲和层析法纯化，使用蛋白质免疫印迹（Western Blot）、免疫组化（Immunohistochemistry）方法验证单克隆抗体识别NCOA5的敏感性及特异性。

1.3 临床资料 选取2007年1月至2012年12月苏州大学附属第一医院及第二医院普外科病理资料完整的乳腺浸润性导管癌手术切除标本100例行免疫组化检测，术前均未接受放化疗或内分泌治疗，其中男2例，女98例；年龄28～88岁，中位年龄50.5岁。按2003年WHO组织学分类标准进行病理分级［10］，其中I级34例、Ⅱ级39例、Ⅲ级27例。淋巴结转移45例、无淋巴结转移55例。根据TNM分期，I期20例、Ⅱa期41例、Ⅱb期30例、＞Ⅲa期9例。

1.4 判断标准 每张切片随机选择5个高倍镜高倍视野综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定，由两位资深病理专家评估。染色强度评分标准：不着色0分、黄色1分、棕黄色2分、黄褐色3分。阳性细胞所占比例评分标准： 阳性细胞数＜ 5%：0分。6%～20%：1分。21%～50%：2分。≥50%：3分。两种评分相乘：0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+）、4～6分为阳性（++）、9分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件。计数资料采用χ2检验或Fishers精确概率检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单克隆抗体的制备 通过PCR成功扩增NCOA5-C-ter基因片段，经酶切、连接构建pET-41a/NCOA5-C-ter重组质粒并转化大肠杆菌感受态BL21（DE3），成功表达可溶性的pET-41a/NCOA5-C-ter重组蛋白用于免疫小鼠。细胞融合后，杂交瘤细胞分泌的上清液通过间接法ELISA筛选挑选出阳性克隆，再通过有限稀释法最终得到一株可识别NCOA5重组蛋白，同时不识别pET-41a载体蛋白的稳定表达的杂交瘤细胞株8B11，经过培养扩增后注射至小鼠腹腔诱生腹水，大量表达抗体并收集纯化，经计算：抗体浓度为1.50mg/ ml，行间接法ELISA检测8B11最高效价为1：32000。

2.2 Western Blot检测抗体特异性 选择乳腺癌细胞系MCF-7及肝癌细胞系HepG2制备蛋白裂解液，分别使用8B11（1：20000）或商品化抗NCOA5多抗（1：2000）作为一抗行Western Blot显示：8B11能识别MCF-7和HepG2细胞中的蛋白，目的条带清晰，大小约65kDa，与抗NCOA5多抗所识别的条带一致；抗NCOA5多抗额外识别HepG2中位于43kDa的条带，与文献报道一致［7］，为突变型的NCOA5即SNCOA5，而8B11不能识别该蛋白；8B11能够识别作为免疫原的pET-41a/NCOA5-C-ter重组蛋白，而多抗不能，结果表明8B11能够特异性识别野生型NCOA5，其识别的抗原表位与商品化抗NCOA5多抗不同。

2.3 免疫组化鉴定抗体特异性 选择病理诊断明确的浸润性乳腺癌及同侧正常乳腺组织5对制片完成免疫组化，其典型表现为：8B11组中乳腺癌细胞核显示强阳性，为棕黄色或褐色颗粒，境界清晰，周围间质细胞仅被苏木素染色，对照的鼠IgG组内乳腺癌细胞未见阳性染色；8B11组中乳腺导管上皮细胞为阴性或个别细胞核弱阳性，对照的鼠IgG组内乳腺癌细胞未见阳性染色。结果表明8B11能够特异性识别组织切片中定位于细胞核的NCOA5。

2.4 NCOA5在乳腺癌中的表达 100例浸润性乳腺癌标本经8B11行免疫组化，结果提示NCOA5定位于细胞核，其中2例细胞核与细胞浆同时存在弱阳性，根据评分标准判读，阴性49例、阳性51例，其中弱阳性（+）37例，中等强度阳性（++）11例，强阳性（+++）3例。见表1。

表1 NCOA5蛋白在浸润性乳腺癌中的表达及与临床病理关系［n（%）］

3 讨论

NCOA5作为重要的核受体共激活因子，在多种细胞中广泛表达，并参与目的基因的转录调控。目前NCOA5的商业化抗体较少，不能满足不同研究需要。文献报道［9］，NCOA5在细胞存在野生型（579个氨基酸）和突变型（SNCOA5，406个氨基酸）两种形式，后者区别在于其C末端突变导致翻译提前终止。为获得能特异性识别野生型或突变型NCOA5的单抗以及满足抗原免疫原性的要求，作者选择表达NCOA5 C端260～579位的氨基酸作为免疫原，通过杂交瘤技术获得单克隆抗体8B11，并利用Western Blot和免疫组化进行验证。在Western Blot实验中，8B11能识别大小约65kDa的抗原蛋白，条带特异，而完整的NCOA5蛋白分子量为65536Da，因而推断8B11所识别的蛋白为NCOA5，为进一步证明这点，作者购买商品化的抗NCOA5多抗进行对照，多抗也能识别位于65kDa处的特异性条带，表明8B11对于细胞内的NCOA5具有良好的亲和力与特异性。另外，商业化多抗额外识别肝癌细胞系HepG2中约43kDa处的特异性条带，结合文献报道［10］，推测为突变型NCOA5（SNCOA5），即其第七内显子上的23个核苷酸移码插入第七外显子造成蛋白质表达提前终止的截短突变体。8B11未能识别该突变体，推测其抗原表位与多抗不同，仅识别野生型NCOA5。另外，8B11可用于免疫组化实验，并显示NCOA5定位于细胞核，与报道一致，结合之前WesternBlot结果，表明8B11能特异性识别细胞核NCOA5。

NCOA5作为转录共调节因子，在肿瘤发生中发挥重要作用。已有研究显示肝癌及食管癌中NCOA5表达下调［7，11］，此外其他肿瘤中尚未见相关报道。本资料首次发现乳腺癌组织中的NCOA5表达，且5对乳腺癌标本均表现为NCOA5高表达，而对应的乳腺导管组织中NCOA5低表达或阴性。由于8B11仅识别野生型NCOA5，不受SNCOA5的影响，和商品化多抗比较，在利用免疫组化技术检测NCOA5的表达时更有意义。为进一步研究NCOA5与乳腺癌的关系，利用免疫组化检测浸润性乳腺癌临床标本中NCOA5的表达，结果提示NCOA5乳腺癌表达阳性率51%，且不同组织标本中表现出强度、染色细胞数量的差异。在与传统的乳腺癌分型指标如年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期和组织学分级等指标比较后发现NCOA5阳性表达在肿瘤＞2cm及存在淋巴结转移的标本中明显升高，与其一致的是随着TNM分期的升高，NCOA5的阳性率呈上升趋势。在乳腺癌的临床病理特征中，较大的肿瘤意味着较差的预后［12］，同时也增加腋淋巴结转移的风险［13］，而淋巴结转移更被认为是预后不良的信号，大量病例研究表明淋巴结转移阴性的患者5年生存率＞90%，而腋淋巴结阳性的患者5年生存率＜70%［14］。表明NCOA5具有评价乳腺癌预后的潜能，其阳性表达可能提示不良预后。

ER、PR、HER2作为经典的评价乳腺癌的指标，其表达水平的高低对于乳腺癌的治疗和预后有重要影响，通过将NCOA5的表达与上述三种受体的比较，作者发现NCOA5在预后较差的ER、PR阴性的乳腺癌标本中阳性率显著升高，达70%左右，类似的情况在核受体共激活因子中也有报道，例如通过检测乳腺癌标本，研究者发现ER表达水平的降低会导致其共激活因子AIB1的mRNA水平升高［15］，而在ER阴性乳腺癌患者中，AIB1过表达意味着不良预后［16］。研究显示NCOA5能作为其他转录因子的共调节因子发挥作用。在神经瘤细胞中NCOA5作为视黄酸相关孤儿核受体α（RORα）的共调解因子参与其对芳香化酶基因CYP19A1表达的调控［6］，而后者正是体内合成雌激素的重要酶。此外NCOA5能够作为共调节因子与孤儿核受体Rev-ERbα结合［4］，Rev-ERbα编码基因位于染色体17q21，与HER2位于同一区域，而该区域经常在乳腺癌中异常扩增，导致Rev-ERbα和HER2共同在乳腺癌中高表达［17］。而Rev-ERbα与另外两种基因异常扩增可以作为ER、PR阴性乳腺癌患者预后的独立预测指标［18］。由此，NCOA5可能与其他转录因子结合发挥作用，而不依赖于ER途经影响乳腺癌的生物学行为，但具体机制有待进一步探索。

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Objective To produce NCOA5 monoclonal antibody and analyze the infl uence of NCOA5 on clinical and pathological parameters by detecting its expression in breast cancer specimens. Methods The monoclonal antibody recognizing NCOA5 protein was produced using hybridoma technique. NCOA5 expression level in breast cancer specimens was detected by immunohistochemistry using monoclonal antibody and the relationship between NCOA5 and clinicopathological parameters was analyzed. Results Mab 8B11 which specially reacted with NCOA5 was identifi ed，the titer and the specifi city was favourable. Immunohistochemistry of breast cancer specimens showed the positive expression rate of NCOA5 correlates with larger tumor size，lymph node metastasis，late TNM stage，negative expression of ER or PR，with statistically signifi cant difference，but has no relationship with age，histologic grade and HER2 status. Conclusion The monoclonal antibody 8B11 specifi cally recognizing endogenous NCOA5 protein was produced. The positive expression rate of NCOA5 in breast cancer correlates with larger tumor size，lymph node metastasis，late TNM stage，negative expression of ER or PR.

NCOA5 monoclonal antibody specifi city Breast cancer

215006 苏州大学附属第一医院普外科（张伟刚 钱海鑫）

215006 苏州大学血液工程中心（何扬）病理室（谢芳）