不同激光辅助孵化对玻璃化冷冻和慢速程序冷冻卵裂期胚胎移植妊娠率的影响

2016-09-12王琦陈蔚清张程

川北医学院学报 2016年4期

关键词：卵裂玻璃化冻融

王琦，陈蔚清，张程

(贵州省人民医院妇科生殖中心，贵州贵阳　550002)

不同激光辅助孵化对玻璃化冷冻和慢速程序冷冻卵裂期胚胎移植妊娠率的影响

王琦，陈蔚清，张程

(贵州省人民医院妇科生殖中心，贵州贵阳550002)

目的：研究分析两种激光辅助孵化方法对玻璃化冷冻和慢速程序冷冻卵裂期胚胎移植妊娠率的影响。方法：对2013年11月到2014年7月期间在我院接受冷冻胚胎移植的160例患者进行临床研究，随机分为两组，对照组为进行激光透明带打孔辅助孵化，研究组进行激光透明带薄化辅助孵化，比较组间患者的临床妊娠结局。结果：胚胎经程序冷冻后,研究组胚胎种植率(19.1%)显著高于对照组(12.3%),差异有统计学意义(P<0.05),而解冻后卵裂球存活率(82.21% vs.77.43%)与临床妊娠率(37.5% vs.32.5%)无显著差异(P>0.05)；胚胎经玻璃化冷冻后，研究组和对照组解冻后卵裂球存活率(87.48% vs.87.41%)、胚胎的临床妊娠率(37.5% vs.35.0%)、种植率(17.5% vs.15.1%)相比较均无统计学差异(P>0.05)；研究组中来源于两种冷冻方法的卵裂期胚胎解冻后卵裂球存活率(87.48% vs.82.21%)、临床妊娠率(37.5% vs.37.5%)和种植率(17.5% vs.19.1%)无统计学差异(P>0.05)。结论：激光透明带削薄优于激光透明带打孔用于辅助孵化，不影响患者的妊娠率，可减少对胚胎的损害。

激光辅助孵化；冻胚移植；妊娠率

【Abstract】Objective：To study the influence of two kinds of laser assisted hatching method on frozen thawed embryo transfer pregnancy rate during cleavage stage by vitrification freezing and slow freezing program.Methods：In our hospital a clinical study was performed on 160 patients with frozen embryo used laser zona drilling assisted hatching,while the study group used laser zona pellucida thinning assisted hatching,clinical pregnancy outcome was compared between two groups.Results：Firstly,after cryopreservation,the embryo implantation rate in study group (19.1%)was significantly higher than that of the control group (12.3%),the difference was statistically significant (P<0.05),while the survival rate after thawing cleavage (82.21% vs.77.43%)and clinical pregnancy rate (37.5% vs.32.5%)had no significant difference (P>0.05);In addition,after vitrification freezing,the thawing cleavage survival rate (87.48% vs.87.41%),the clinical pregnancy rate of embryo (37.5% vs.35%)and implantation rate(17.5% vs.15.1%)had no statistically significant difference (P>0.05);What is more,the thawing cleavage survival rate (87.48% vs.82.21%),the clinical pregnancy rate of embryo (37.5% vs.37.5%)and the implantation rate (17.5% vs.19.1%)in the study group from two freezing methods,had no significant difference (P>0.05).Conclusion：The laser zona pellucida thinning assisted hatching is superior to laser zona drilling assisted hatching,it doesn't affect the patient’s pregnancy rate and can reduce the damage for the embryo.

【Key words】Laser assisted hatching;Frozen embryo transfer;Pregnancy rate

辅助孵化被用于辅助生殖相关技术已具有较长的时间，近几年随着显微激光相关医学的快速发展，激光系统由于具有快速、安全、准确等优点而被引入到辅助孵化，且已获得较好的临床效果[1-2]。本文关于两种激光辅助孵化方法对人类早期胚胎解冻后移植妊娠率的影响进行研究分析，所研究的结果报道如下。

1　资料和方法

1.1一般资料

将2013年11月到2014年7月期间在我院接受冻融胚胎移植的160例患者作为临床研究对象，按照随机的原则分为两组，每组80例，对照组中患者的年龄为27～40岁，平均年龄为(35.6±1.2)岁，该组患者子宫膜厚度平均值为(10.6±1.2)mm；研究组中患者的年龄为26～39岁，平均年龄为(35.3±1.0)岁，该组患者子宫膜厚度平均值为(10.7±1.6)mm。两组排除了宫腔因素引起的不孕患者，且年龄、子宫内膜厚度相似，差异无统计学意义(P>0.05)，可以进行对比分析。

1.2方法

1.2.1D3胚胎评级参照胚胎分级[3]1级：胚胎卵裂球大小均匀，形态规则，透明带完整；胞质均匀清晰，没有颗粒现象，碎片0%～5%；2级：胚胎卵裂球大小略不均匀，形态略不规则，胞质可有颗粒现象，碎片10%～20%之间；3级：胚胎卵裂球明显大小不均，可有明显的形状不规则，胞质可有颗粒现象，胞质碎片21%～50%；4级：胚胎卵裂球大小严重不均，胞质可有严重颗粒现象，胞质碎片>50%。

1.2.2冷冻胚胎选择(1)正常受精；(2)D1、D2、D3连续发育；(3)D2 在2细胞以上，D3卵裂球数≥6个；(4)胚胎评级2级以上；解冻后胚胎移植的标准：胚胎解冻后有超过50%的卵裂球存活的胚胎认为胚胎解冻后复苏，并用于移植。

1.2.3胚胎慢速程序冷冻及解冻法(1)胚胎冷冻：冷冻试剂盒Quinn’s胚胎冷冻配套培养基。操作步骤：胚胎于37℃移入Fl(冷冻稀释培养基(含10%SPS的HEPES液))中，将胚胎在培养皿的不同区域反复冲洗，放置10 min；移入F2(1.5 M PPD溶液)中，于室温平衡10 min；移入F3(1.5 M PPD+0.1 M蔗糖溶液)中，装入冷冻麦管并封好管口。将冷冻管置入已在起始温度的程序冷冻仪(英国Planer公司)中，开始冷冻从室温(25℃)开始，以2 ℃/min的速度从室温降至-8 ℃，当温度稳定在-8 ℃时，进行植冰，并停留10 min，之后以-0.3 ℃/min的速度从-8 ℃降至-30 ℃，再以10 ℃/min的速度从-30 ℃降至-150 ℃，投入液氮，并转移至保存罐中。(2)胚胎解冻：解冻试剂盒Quinn’s胚胎解冻配套培养基。从液氮罐中取出麦管。在空气中保持30～40 s。投入37 ℃水浴，30 s，直到冰完全融化，然后将胚胎移入0.5 M蔗糖解冻液中10 min，再移至0.2 M蔗糖解冻液中5 min之后移入HEPES培养基(含10%SPS)中洗7次，最后移至预平衡的卵裂培养基中待行辅助孵化。

1.2.4玻璃化冷冻和解冻法试剂为瑞典Vitrolife卵裂期胚胎玻璃化冷冻/解冻配套培养基。按照试剂盒说明进行冷冻及复苏。(1)胚胎冷冻：所有的操作均在37 ℃热台上进行，把胚胎放入基础液(不含冷冻保护剂)里平衡5～10 min，然后将胚胎移入以乙二醇作为冷冻保护剂的培养基中2 min，最后在含有丙二醇、聚蔗糖和蔗糖为冷冻保护剂的冷冻液中平衡，30 s内将胚胎移入低温冷冻载体(瑞典Vitrolife封闭式载体)上并转移入液氮中保存。(2)胚胎解冻：把冷冻载体从液氮中取出，然后迅速放入Warm1里10～30 s后移入Warm2中1 min后，再移入Warm3中平衡2 min，最后将胚胎置入基础液中平衡5 min，后移入预先平衡的卵裂培养基中等待行辅助孵化。

1.2.5辅助孵化显微激光操作系统(美国ZILOS-tK系统)。对照组进行激光透明带打孔辅助孵化，选取胚胎卵周隙的最大位置持续的以2～3 ms的激光能量进行激光打孔将部分胚胎透明带切除掉，需保证中心部分完全的穿透透明带，尽量避免伤害到胚胎细胞，并将胚胎移到培养液滴中置于培养箱保存以等待进行移植；研究组进行激光透明带削薄辅助孵化，选取胚胎卵周隙的最大位置以4～6 ms的激光能量将削薄1/4左右的胚胎透明带，削掉约50%～80%的透明带厚度，并防止穿透透明带，将胚胎移到培养液滴中置于培养箱保存以等待进行移植。对对照组80例进行激光透明带打孔辅助孵化，对研究组80例进行激光透明带削薄辅助孵化，并且每组均有40例为程序冷冻、40例为玻璃化冷冻。将经激光辅助孵化后的卵裂期胚胎在腹部B超的指导下移植到患者的宫腔，并于移植后对患者使用黄体酮或者HCG进行黄体支持。

1.3统计学分析

2　结果

胚胎经程序冷冻后,研究组(激光透明带削薄)胚胎种植率(19.1%)高于对照组(激光透明带打孔)(12.3%),差异有统计学意义(P<0.05),而解冻后卵裂存活率(82.21% vs.77.43%)与临床妊娠率(37.5% vs.32.5%)差异无统计学意义(P>0.05)；胚胎经玻璃化冷冻后，研究组和对照组解冻后卵裂存活率(87.48% vs.87.41%)、胚胎的临床妊娠率(37.5% vs.35.0%)、种植率(17.5% vs.15.1%)相比较均无统计学差异(P>0.05)；研究组中来源于2种冷冻方法的卵裂期胚胎解冻后卵裂存活率(87.48% vs.82.21%)、临床妊娠率(37.5% vs.37.5%)和种植率(17.5% vs.19.1%)无统计学差异(P>0.05)。详细情况如表1、表2所示。

表1　两组患者的解冻后卵裂球存活率(%)

表2　两组患者妊娠率与种植率对比(%)

3　讨论

由于透明带能进行局部的裂解是囊胚可以正常的孵出和种植的关键因素，而囊胚在体内的动力学相关变化和小分子物质的相互作用可引起透明带逐渐的扩张及变薄，并于局部出现溶解、断裂，进而使囊胚的正常孵出及成功种植得到保证[4-5]。但由于所冻融的胚胎透明带会受到相关理化因素的影响，使糖蛋白的基质出现改变致使透明带变硬而对囊胚的孵出情况造成一定的影响，所以在对冻融胚胎进行移植之前进行一定的辅助孵化已被逐渐推广，然而进行辅助孵化是否可以使所冻融胚胎的妊娠率及种植率得到提高尚具有一定的争议，可能是与所选取的研究对象(如卵裂期胚胎、囊胚)、冷冻的方法(进行程序冷冻、玻璃化冷冻)、辅助孵化的方法(进行化学喷酸辅助孵化、激光辅助孵化)、透明带的处理程度(进行透明带的打孔、薄化、切除)等存在不同具有一定关系[6-7]。一般情况下，冻融囊胚的孵出多选择切除透明带法，激光薄化法和激光打孔法则常被用于卵裂期胚胎，并且，对透明带进行激光薄化法比激光打孔法出现孵化嵌顿的情况较少，对于胚胎的安全性更高，临床使用更加广泛[8]。

本研究显示，程序冷冻及玻璃化冷冻下的胚胎复苏情况之间的差异不明显(P>0.05)，但研究组与对照组中玻璃化冷冻的解冻后卵裂球存活率明显高于程序冷冻(P<0.05)，在程序冷冻及玻璃化冷冻情况下研究组的妊娠率高于对照组，但组间差异不明显(P>0.05)，提示玻璃化冷冻虽然与程序冷冻的临床结局无差异，但玻璃化冷冻后解冻卵裂球的完整率高，且玻璃化冷冻耗时较短；另外，在程序冷冻解冻之后研究组的种植率明显高于对照组，(P<0.05)，而玻璃化冷冻之后研究组的种植率差异不明显(P>0.05)，说明与激光透明带打孔辅助孵化相比，激光透明带削薄辅助孵化可使程序冷冻的胚胎的种植率得到明显提高，而对玻璃化冷冻下种植率无明显影响。总之，进行玻璃化冷冻解冻后胚胎的质量要明显的优于进行程序冷冻的结果，但在玻璃化冷冻情况下进行激光透明带打孔与激光透明带削薄辅助孵化后的妊娠率和种植率与在程序冷冻下相比差异不明显。目前对于辅助孵化是否改善了IVF的临床结局尚存在争议，但我们的观点认为它是有用的，也许它有助于克服孵化前的机构性阻力，减少了胚胎完成孵化过程所需要的能量从而更利于胚胎的种植。从本研究的结果来看进行激光透明带削薄比激光透明带打孔辅助孵化的胚胎种植率更好，也许它更类似于胚胎在自然孵化过程中透明带自然减薄的过程，并且可能避免对胚胎产生的某些损伤，对胚胎的安全性较好，并且临床的妊娠率较好，具有一定的临床意义。

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[3]邓晓惠．生殖医学技术及其彩色图谱[M]．济南:山东科学技术出版社，2004:20-22.

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(学术编辑：李佳平)

Effects of two kinds of laser assisted hatching method on frozen thawed embryo transfer pregnancy rate during cleavage stage

WANG Qi，CHEN Wei-qing,ZHANG Cheng

(Gynecological Reproductive Center,Guizhou Provincial People’s Hospital,Guiyang 550002,Guizhou,China)